Producción recombinante del nanocuerpo KN035 utilizando Chlamydomonas Reinhardtii como organismo de expresión

Abstract

La microalga verde Chlamydomonas reinhardtii ha sido utilizada como modelo de estudio clásico en áreas como fotosíntesis, motilidad celular, control ciclo celular, entre otras. En particular, durante el último tiempo se ha ido transformando en un organismo de interés para el área biomédica con diversas aplicaciones. Desde liberación in situ de oxígeno para el tratamiento de heridas crónicas en ambientes hipóxicos, promoviendo su regeneración, hasta la producción recombinante de factores de regeneración u otros tipos de metabolitos con alcances terapéuticos. En este último grupo destacan los llamados Nanocuerpos: pequeños fragmentos peptídicos de alrededor de 15 [kDa] que mantienen la misma capacidad de unión a un antígeno que la que tiene un anticuerpo convencional. Hasta el momento existe sólo un antecedente de producción a nivel de cloroplasto de tres distintos tipos de estas moléculas utilizando C. reinhardtii, pero diseños que permitan la liberación local de nanocuerpos desde este organismo no han sido publicados. Un nanocuerpo de particular importancia es KN035, asociado a la interrupción específica de la vía checkpoint inmunológica PD1-PD-L1, la cual naturalmente se asocia a fenómenos de auto-tolerancia inmunológica. Sin embargo, en presencia de neoplasias ha mostrado ser una ruta para que células tumorales cancerígenas puedan suprimir la actividad de los linfocitos T circundantes. En el presente trabajo se propuso como objetivo general generar una cepa recombinante de C. reinhardtii que permitiese la producción del nanocuerpo KN035 en miras futuras de una posible aplicación para liberación in situ de dicha molécula en tumores. Utilizando herramientas bioinformáticas se diseñó un casete de expresión que permitiese la producción y secreción al medio del nanocuerpo KN035. Por medio de Gibson Asembly se produjo satisfactoriamente un vector para la transformación de C. reinhardtii y la incorporación nuclear de este casete, comprobandose por PCR el éxito de la transformación y la presencia de dicho casete en el DNA genómico en tres poblaciones clonales. Finalmente, mediante ensayos de RT-PCR se corroboró satisfactoriamente que dos de dichas cepas, 11K1 y 11K5 mostraban presencia del transcrito asociado a KN035. Futuros ensayos serán necesarios para poder comprobar la presencia de la proteína tanto en el medio intracelular como extracelular, así como también la funcionalidad del producto recombinante aquí obtenido.

The green microalgae Chlamydomonas reinhardtii has been used as a model organism in different areas of research, such as photosynthesis, cellular motility and cellular cycle control, among others. Recently, C. reinhardtii has become increasingly important in the biomedical field due its many applications, from the in-situ delivery of oxygen for the treatment of the hypoxic chronical wounds, to the recombinant production of regenerative factors or numerous other therapeutic metabolites. Nanobodies are metabolites that has shown particular importance, they are short peptide fragments of around 15 [kDa], which demonstrate the same affinity for an antigen as a heavy chain antibody. To date, there is just one report in which C. reinhardtii has been used as a cell factory for three nanobodies, using chloroplast transformation, but strategies to allow the in-situ delivery remains unpublished. On nanobody, KN035, is of particular interest, as it is associated with the specific interruption of the immunological checkpoint pathway PD1-PD-L1, which is associated to immune autotolerance, which plays a role in the inactivation of T-cells and tumor proliferation. In this work, our major aim was the generation of a recombinant strain of C. reinhardtii that produces this KN035 nanobody in such a way that could potentially support the in-situ delivery of KN035 in cancer tumors. Using bioinformatic tools we have designed an expression cassette that allows the expression and secretion of KN035 to the extracellular medium. Making use of Gibson Assembly we have developed a functional vector that allows the transformation of C. reinhardtii and the incorporation of this expression cassette, which was checked by PCR showing a successful transformation and the presence of the cassette in 3 different clonal lines. Lastly, we have subjected these clonal lines to an RT-PCR assay where we have corroborated that two strains, 11K1 and 11K5, produce the KN035 mRNA transcript. Future assays will be necessary to verify the presence of protein in both the extracellular and the intracellular medium, as well as the functionality of the protein produced.