Vesículas extracelulares liberadas de la línea celular gástrica GES-1 infectada con Helicobacter pylori promueven características asociadas al desarrollo y la progresión del cáncer gástrico

Abstract

El cáncer gástrico (CG) es la cuarta causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer y el quinto cáncer más común en todo el mundo. En Chile, la situación es aún más alarmante, ya que el país ocupa el primer y quinto lugar, en cuanto a mortalidad e incidencia, respectivamente, en Latinoamérica. El CG se puede clasificar principalmente en dos tipos: el CG difuso, asociado a factores hereditarios y el CG intestinal, más asociado a factores ambientales. Entre los factores de riesgo asociados al desarrollo de CG intestinal se encuentran la infección por la bacteria Helicobacter pylori (H. pylori). H. pylori es una bacteria gram-negativa que coloniza el epitelio gástrico, y se estima que al menos el 50% de la población adulta en todo el mundo posee esta bacteria. Los efectos oncogénicos de H. pylori en las células epiteliales se atribuyen directamente a la acción tóxica de los factores de virulencia expresados por la bacteria como CagA, VacA, GGT, Ureasa, entre otros, o indirectamente a los procesos inflamatorios producidos por la infección. En específico, la carcinogénesis gástrica inducida por H. pylori está asociada con inflamación crónica, caracterizada por el aumento de citoquinas pro-inflamatorias. Por otro lado, la infección con H. pylori ocasiona el silenciamiento de genes que funcionan como supresores de tumores y cambios a nivel celular en células gástricas y endoteliales, incluidos cambios en viabilidad y supervivencia celular, migración celular, entre otros. Estos hallazgos provienen de experimentos realizados in vitro, en células de cáncer gástrico o de estudios clínicos, realizados en pacientes infectados con H. pylori. Por último, recientes evidencias indican que la infección con H. pylori también ocasiona cambios en la comunicación celular mediada por Vesículas Extracelulares (EVs). La comunicación celular a través de EVs es importante en procesos fisiológicos y fisiopatológicos como las infecciones por patógenos, enfermedades autoinmunes y el cáncer. Sin embargo, aún se sabe muy poco acerca de los cambios que ocurren en la comunicación celular mediada por EVs en el contexto de infección con H. pylori. Estos antecedentes nos llevaron a plantear la siguiente hipótesis: “EVs liberadas de línea celular gástrica GES-1 infectada con H. pylori promueven inflamación, angiogénesis y características asociadas a la progresión del cáncer”. Por consiguiente, el objetivo principal de esta tesis fue: demostrar que las EVs liberadas de la línea celular gástrica GES-1 infectada con H. pylori, promueven en células receptoras aumento de citoquinas pro-inflamatorias, y afectan procesos celulares como la proliferación, migración celular, invasión celular, migración transendotelial y formación de redes endoteliales vinculadas. Con los siguientes objetivos específicos: 1) Determinar en células GES-1 infectada con H. pylori cambios en: niveles de las proteínas E-cadherina y Caveolina-1; expresión de citoquinas pro-inflamatorias; y procesos celulares como proliferación y migración celular. 2) Evaluar cambios en la liberación de EVs de células GES-1 infectadas con H. pylori. Y por último 3) Determinar el rol de las EVs purificadas de células GES-1 infectadas con H. pylori en el aumento de citoquinas pro-inflamatorias, cambios en proliferación, migración celular, invasión celular, migración transendotelial y formación de redes endoteliales vinculadas, en células receptoras. Los resultados mostraron que la infección con H. pylori en las células gástricas no transformadas GES-1, indujo disminución de los niveles proteicos relativos de E-cadherina, una proteína que funciona como supresor de tumores. A su vez, indujo aumento de los niveles proteicos de Caveolina-1, una proteína que tienen un rol dual antagónico en cáncer, el cual depende del tipo de cáncer y estadio de la enfermedad. Adicionalmente, la infección con H. pylori en células GES-1 redujo en un ~20% la viabilidad celular; indujo el aumento de la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-a IL-8 e IL-6; y disminuyó la migración celular en un ~50%. Adicionalmente, la infección con H. pylori en células GES-1 ocasionó un aumento de 2 veces en la liberación de EVs. Las EVs liberadas de células GES-1 infectadas con H. pylori (EVHp+) tuvieron un tamaño promedio ligeramente menor pero significativo comparado con las EVs aisladas de células no infectadas con H. pylori (EVHp-) (206 nm vs 227 nm, respectivamente). Por otro lado, en ambos tipos de EVs aisladas (EVHp- y EVHp+) se detectaron marcadores de EVs mediante Western blot. Se evaluó el efecto biológico de las EVs liberadas de células GES-1 infectadas o no con H. pylori, en células receptoras, incluyendo las células gástricas GES-1, células de cáncer gástrico AGS y las células endoteliales EA.hy926, realizando varios ensayos. El estímulo con EVHp+ redujo ~20% la viabilidad celular de células GES-1, pero no indujo cambios en la viabilidad de las células de cáncer gástrico AGS. El estímulo de células GES-1 con EVHp- indujo aumento de las citoquinas IL-1b e IL-23, más aún el estímulo de células GES-1 con EVHp+ indujo aumento de la expresión de IL-6 y mayores aumentos de las citoquinas IL- 1b e IL-23. Por el contrario, el estímulo de células AGS con EVHp- o EVHp+ no indujo cambios en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias. El estímulo de células GES-1 con EVHp- aumentó la migración celular, sin embargo, se observó un aumento aun mayor de la migración celular cuando el estímulo fue realizado con EVHp+. Por otro lado, en las células AGS solo el estímulo con EVHp+ aumentó la migración celular. Además, solamente el estímulo con EVHp+ en células GES-1 y AGS aumentó la invasión celular en Matrigel y la migración a través de una monocapa de células endoteliales EA.hy926 (migración transendotelial). Finalmente, el estímulo de células endoteliales EA.hy926 con EVHp+ aumentó la formación de redes vasculares. Si bien la infección con H. pylori ocasionó un aumento en la liberación de EVs de las células GES-1, los estímulos se realizaron considerando la misma cantidad de proteínas totales para ambos tipos de EVs. Esto indica que las diferencias obtenidas en los ensayos biológicos al realizar los estímulos con EVHp- o EVHp+, implican diferencias en composición de éstas EVs. Debido a que las proteínas forman parte importante de las moléculas contenidas en las EVs, se realizó un análisis de proteómica de las EVHp- y EVHp+ mediante espectrometría de masas. Mediante los resultados del análisis por espectrometría de masas de las EVs, se identificaron proteínas únicamente presentes en EVHp+ importantes en procesos de migración e invasión celular como por ejemplo la ADAM Metalopeptidasa con motivo de trombospondina tipo 13, la molécula de adhesión de células leucocitarias activadas (ALCAM), Follistatin Like 1 (FSTL1) y vitronectina (VTN), y otras enriquecidas en EVHp+, importantes para la biogénesis de exosomas (Anexina A2, Anexina A5, CD63, CD81, HSPA1, HSP90, Rab-7a y Rap-1b) y para la adhesión y migración celular (Syndecan-4 y Syndecan Binding Protein). Estas proteínas encontradas exclusivamente o enriquecidas en EVHp+ en comparación con EVHp-, podrían estar relacionadas con la adquisición o aumento de los rasgos malignos evaluados en este trabajo, y que son importantes para la progresión de los cambios preneoplásicos gástricos asociados con la infección por H. pylori. Vale la pena recalcar que, los resultados mostraron que las células GES-1 liberan mayor cantidad de EVs luego de infección con H. pylori, con lo cual podemos inferir que los efectos observados acá por el estímulo con las EVHp+ en células receptoras, se podrían ver aun más aumentados en un contexto de infección con H. pylori, tanto en células gástricas no transformadas como células de cáncer gástrico. En conclusión, los efectos perjudiciales ocasionados por la infección con H. pylori asociados con la malignidad gástrica podrían propagarse a través de las EVs en etapas tempranas y tardías de la carcinogénesis gástrica

Gastric cancer (GC) is the fourth leading cause of cancer-related mortality and the fifth most common cancer worldwide. In Chile, the situation is even more alarming, since the country ranks first and fifth, in terms of mortality and incidence, respectively, in Latin America. GC can be classified mainly into two types: diffuse GC, associated with hereditary factors, and intestinal GC, more associated with environmental factors. Among the risk factors associated with the development of intestinal GC are infection by the bacterium Helicobacter pylori (H. pylori). H. pylori is a gram-negative bacterium that colonizes the gastric epithelium, and it is estimated that at least 50% of the adult population worldwide has this bacterium. The oncogenic effects of H. pylori on epithelial cells are directly attributed to the toxic action of virulence factors expressed by the bacteria such as CagA, VacA, GGT, Urease, among others, or indirectly to the inflammatory processes produced by the infection. Specifically, H. pyloriinduced gastric carcinogenesis is associated with chronic inflammation, characterized by increased pro-inflammatory cytokines. On the other hand, infection with H. pylori causes the silencing of genes that function as a tumor suppressor and changes at the cellular level in gastric and endothelial cells, including changes in cell viability and survival, cell migration, among others. These findings come from in vitro experiments on gastric cancer cells or from clinical studies in patients infected with H. pylori. Finally, recent evidence indicates that H. pylori infection also causes changes in cell communication mediated by Extracellular Vesicles (EVs). Cellular communication through EVs is important in physiological and pathophysiological processes such as infections by pathogens, autoimmune diseases, and cancer. However, about the changes that occur in EV-mediated cellular communication in the context of H. pylori infection, very little is known. These antecedents led us to propose the following hypothesis: "EVs released from gastric cell line GES-1 infected with H. pylori promote inflammation, angiogenesis and characteristics associated with cancer progression" Therefore, the main objective of this thesis was: To demonstrate that the EVs released from the gastric cell line GES-1 infected with H. pylori, promote an increase in pro-inflammatory cytokines in recipient cells, and affect cellular processes such as proliferation, migration cell, cell invasion, transendothelial migration and formation of linked endothelial networks. With the following specific objectives: 1) To determine in GES-1 cells infected with H. pylori changes in: levels of the proteins E-cadherin and Caveolin-1; expression of pro-inflammatory cytokines; and cellular processes such as cell proliferation and migration. 2) Evaluate changes in the release of EVs from GES-1 cells infected with H. pylori. And finally, 3) To determine the role of purified EVs from GES-1 cells infected with H. pylori in the increase of proinflammatory cytokines, changes in proliferation, cell migration, cell invasion, transendothelial migration and formation of linked endothelial networks, in recipient cells. The results showed that H. pylori infection in non-transformed GES-1 gastric cells induced a decrease in the relative protein levels of E-cadherin, a protein that functions as a tumor suppressor. In turn, it induced an increase in the protein levels of Caveolin-1, a protein that has a dual antagonistic role in cancer, which depends on the type of cancer and the stage of the disease. Additionally, H. pylori infection in GES-1 cells reduced cell viability by ~ 20%; induced increased expression of pro-inflammatory cytokines TNF-a IL-8 and IL-6; and decreased cell migration by ~50%. Additionally, H. pylori infection in GES-1 cells caused a 2-fold increase in EV release. The EVs released from GES-1 cells infected with H. pylori (EVHp+) had a slightly smaller but significant average size compared to EVs isolated from cells not infected with H. pylori (EVHp-) (206 nm vs 227 nm, respectively). On the other hand, in both types of EVs isolated (EVHp- and EVHp+), markers of exosomes were detected by Western blot. The biological effect of EVs released from GES-1 cells infected or not with H. pylori was evaluated in recipient cells, including gastric GES-1 cells, gastric cancer AGS cells and endothelial EA.hy926 cells, by performing several tests. Stimulation with EVHp+ reduced ~20% cell viability of GES-1 cells, but did not induce changes in viability of gastric cancer AGS cells. The stimulation of GES-1 cells with EVHp- induced an increase in the cytokines IL-1b and IL-23, furthermore, the stimulation of GES-1 cells with EVHp+ induced an increase in the expression of IL-6 and greater increases in cytokines. IL-1b and IL-23. On the contrary, the stimulation of AGS cells with EVHp- or EVHp+ did not induce changes in the expression of pro-inflammatory cytokines. The stimulation of GES-1 cells with EVHpincreased cell migration, however an even greater increase in cell migration was observed when the stimulation was performed with EVHp+. On the other hand, only stimulation with EVHp+ in AGS cells increased cell migration. Furthermore, only stimulation with EVHp+ in GES-1 and AGS cells increased cell invasion in Matrigel and migration through an EA.hy926 endothelial cell monolayer (transendothelial migration). Finally, the stimulation of EA.hy926 endothelial cells with EVHp+ increased the formation of linked vascular networks. Although infection with H. pylori caused an increase in the release of EVs from GES-1 cells, the stimuli were performed considering the same number of total proteins for both types of EVs. This indicates that the differences obtained in the biological tests when carrying out the stimuli with EVHp- or EVHp+, imply differences in the composition of these EVs. Since proteins are an important part of the molecules contained in EVs, a proteomic analysis of EVHp- and EVHp+ was performed by mass spectrometry. Through the results of the mass spectrometric analysis of the EVs, proteins only present in EVHp+ important in cell migration and invasion processes such as ADAM Metallopeptidase with type 13 thrombospondin motif, activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM), Follistatin Like 1 (FSTL1) and vitronectin (VTN), and others enriched in EVHp+ , important for exosome biogenesis (Annexin A2, Annexin A5, CD63, CD81, HSPA1, HSP90, Rab-7a and Rap-1b) and for cell adhesion and migration (Syndecan-4 and Syndecan Binding Protein). These proteins found exclusively or enriched in EVHp+ compared to EVHp-, could be related to the acquisition or increase of the malignant traits evaluated in this work, and which are important for the progression of gastric preneoplastic changes associated with H. pylori. It is worth emphasizing that the results showed that the GES-1 cells release a greater amount of EVs after infection with H. pylori, with which we can infer that the effects observed here by the stimulation with the EVHp+ in recipient cells could be see even more increases in the context of H. pylori infection, both in non-transformed gastric cells and gastric cancer cells. In conclusion, the detrimental effects caused by H. pylori infection associated with gastric malignancy could spread through the Extracellular Vesicles in early and late stages of gastric carcinogenesis