Ingeniería de cofactor en Escherichia coli integrando ingeniería de proteínas y metabolismo para una fermentación láctica dependiente de NADPH

Abstract

La producción de ácido láctico (LA) se ha convertido en un proceso industrialmente atractivo durante los últimos años. Para producir LA, la D-lactato deshidrogenasa requiere NADH como cofactor. Un reciente interés en modular la especificidad de cofactor de esta enzima ha motivado la producción de LA en huéspedes bacterianos no usuales que usen fuentes de electrones alternativas. Esta tesis se centró primero: en estudiar la especificidad por cofactor, el comportamiento cinético y las propiedades estructurales de la D-lactato deshidrogenasa de Escherichia coli (EcLDH); y luego, en generar y expresar variantes de EcLDH NADPH-preferentes en una cepa de E. coli carente de fosfoglucosa isomerasa (Δpgi) con el fin de acoplar la sobreproducción de NADPH con la síntesis de LA dependiente del mismo cofactor. La EcLDH presentó un mecanismo cinético secuencial ordenado donde el cofactor entra primero y sale último. Observamos que la enzima es regulada alostéricamente por piruvato. Dos complejos cristalográficos de punto muerto revelaron un sitio alostérico putativo para piruvato, formado en la interfaz entre los dominios C-terminales de dos de las cuatro subunidades. EcLDH es 160 veces más específica para NADH que NADPH, resultado que es consistente con la estructura cristalográfica que fue resuelta para la enzima en complejo con NADH. Para revertir la especificidad por cofactor se utilizó un enfoque racional basado en el análisis de potenciales estadísticos y estudios evolutivo-estructurales a nivel de superfamilia y familia. Se obtuvo un incremento en la especificidad para NADPH, dando cuenta de una enzima mutante 9200 veces más preferente por NADPH que la enzima silvestre. Se cristalizaron y difractaron cristales de enzimas mutantes. Los resultados de las estructuras cristalográficas sugirieron que, cambios en la flexibilidad del loop b7-a7 y la presencia de dos cargas positivas favorecen la interacción con NADPH. Para evaluar la producción de LA, se diseño la cepa de Escherichia coli (Δpgi Δlac) que sobre produce NADPH cuando se usa glucosa como única fuente de carbono. En esta cepa se expresaron dos EcLDH NADPH-preferentes y se observó una recuperación en la tasa de crecimiento consistente con la producción de D-lactato a través de la reoxidación in vivo de NADPH. Los resultados proporcionan una base para comprender como modular la especificidad por cofactor en LDH con el fin de mejorar la producción de LA en cepas ingenierizadas que dispongan de NADPH como fuente principal de poder reductor.

Lactic acid (LA) production by fermentation in bacteria has become an industrially attractive process in the last few years. To produce LA, NADH is required as a cofactor by the Dlactate dehydrogenase. Recent interest in modulating the cofactor specificity of this enzyme has motivated the production of LA in different bacterial hosts. This thesis focused first: on studying the cofactor specificity, kinetic behavior, and structural properties of the D-lactate dehydrogenase from Escherichia coli (EcLDH); and then on the expression of reverted cofactor-specificity LDH in a null phosphoglucose isomerase E. coli strain (Δpgi) to couple the NADPH overproduction with the NADPH-dependent LA synthesis. The EcLDH possesses an ordered sequential kinetic mechanism where cofactor entry and out first and last, respectively. The enzyme is regulated allosterically by the substrate pyruvate. Crystallographic complexes of EcLDH revealed a putative allosteric site for pyruvate, formed at the interface between the C-terminal domains of two different subunits. Regarding the cofactor specificity, EcLDH was 160-fold more specific for NADH than NADPH. Thence, we employ a rational approach based on protein-ligand energetic potentials statistical analysis and structural and evolutive studies at superfamily and family levels to modulate the cofactor specificity from NADH to NADPH. We obtained an increase of specificity for NADPH almost 9200-fold over the wild-type enzyme. To structurally explain this enhancement, we crystallized and diffracted mutant enzymes complexed with each cofactor. The flexibility of loop b7-a7 and the presence of two positive charges favor the NADPH interaction. To evaluate the LA production by an NADPH-dependent LDH, we designed an Escherichia coli strain (Δpgi Δlac-) that overproduces NADPH when glucose is used as a unique carbon source. Two EcLDH NADPHpreferent were expressed in the Δpgi Δlac- strain observed a recovery in the growth rate consistent with the production of D-lactate through in vivo re-oxidation NADPH. Our results provide the basis to understand the cofactor specificity to enhance LA production in an engineering strain using NADPH employing fermentation-independent processes.