Efecto de la variante genética RS4541843:C>T en los niveles del microrna-182 y en la inhibición de la traducción del RNA mensajero de BRCA1

Abstract

El cáncer de mama (CM) corresponde a la neoplasia maligna más prevalente en mujeres en el mundo. En Chile, el CM es uno de los 5 cánceres más frecuentes, con una incidencia de 46,3 por cada 100.000 mujeres y mortalidad de 16,6 por cada 100.000 mujeres. Los factores de riesgo asociados al desarrollo del CM corresponden a género, edad, factores nutricionales y modo de vida, factores reproductivos, factores hormonales y factores genéticos. El factor de riesgo más importante es la predisposición o susceptibilidad genética, la cual es responsable del 5-15% de todos los casos de CM. En los años 1994 y 1995 se descubrieron los genes BRCA1 y BRCA2, los que han sido considerados genes de susceptibilidad de alta penetrancia. Las mutaciones en BRCA1 y BRCA2 son responsables del 16-20% del riesgo de CM familiar. Se ha propuesto que otros genes, denominados de moderada y baja penetrancia podrían ser responsables del 80% restante de los casos con CM familiar BRCA1/2-negativos. Las mutaciones en el gen BRCA1, son responsables aproximadamente del 54% del riesgo de desarrollar CM. Varios estudios han demostrado que la expresión de BRCA1 está regulada por miRNAs. Se ha predicho que entre 20-100 miRNAs se unen a la región 3’UTR del mRNA de BRCA1. El miRNA-182 es uno los miRNAs que tienen como blanco a la región 3'UTR del mRNA del gen BRCA1. La literatura ha sugerido que el miRNA-182 es un miRNA oncogénico involucrado en la progresión de tumores malignos, promoviendo la proliferación y migración de las células cancerígenas. El grupo de Moskwa (2011) demostró que el miRNA-182 tiene como blanco a la región 3'UTR del mRNA del gen BRCA1 y que mayores niveles del miRNA disminuyen la expresión de BRCA1. Los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) son el tipo más común de variación en el genoma humano. Los SNPs en genes de miRNAs pueden afectar: el procesamiento, la maduración del miRNA o la interacción del miRNA con el mRNA blanco. Se han realizado estudios de asociación entre polimorfismos de miRNAs y riesgo de CM. Estudios recientes identificaron el SNP rs4541843:C>T, el cual se encuentra en la región del precursor pri-miRNA-182. Morales et al. (2018) establecieron que la variante rs4541843:C>T en el pri-miR-182 se asocia con riesgo de CM familiar en población chilena. En base a los antecedentes expuestos, en esta tesis, se propuso evaluar el efecto del rs4541843:C>T sobre los niveles del miRNA-182 maduro y sobre la unión del miRNA-182 al mRNA de BRCA1. Para ello, se evaluó los niveles del miRNA-182 maduro en presencia del rs4541843 alelo T y C por medio de RT-qPCR. Para determinar el efecto del SNP rs4541843:C>T en la unión del miRNA-182 a la región 3’UTR del mRNA de BRCA1, se realizó un ensayo de luciferasa. Los resultados mostraron una mayor presencia de la hebra 3p del miRNA-182 maduro en las líneas celulares de CM transfectadas con el pri-miRNA-182-C en comparación con aquellas transfectadas con el alelo T. Además, estos niveles mayores se detectan en presencia del alelo C del rs4541843, lo que indicaría que el alelo C de este SNP es el alelo de riesgo. Con respecto al efecto del SNP rs4541843:C>T en la unión a la región 3’UTR del mRNA de BRCA1, los resultados obtenidos indicaron que hay un aumento significativo en la unión del miRNA-182 a la región 3’UTR del mRNA de BRCA1 cuando las células son transfectadas con el alelo C en comparación con aquellas transfectadas con el vector vacío. Lo anterior permite concluir que el alelo C del rs4541843:C>T en el pri-miRNA-182, es el alelo de riesgo. Estos resultados son importantes para los pacientes BRCA1/2-negativos, ya que si son portadores de la variante C en el pri-miRNA-182 podrían tener niveles muy bajos de la proteína BRCA1 y ser equivalentes a pacientes con mutaciones germinales en BRCA1. Por lo tanto, la variación genética en el primiRNA- 182 podría explicar en parte la presencia de CM en pacientes cuya etiología genética aún no ha sido establecida

Breast cancer (BC) is the most prevalent malignancy in women worldwide. In Chile, BC is one of the five most frequent cancers, with an incidence rate of 46.3 per 100,000 women and a mortality rate of 16.6 per 100,000 women. The risk factors associated with the development of BC are gender, age, nutritional and lifestyle factors, as well as reproductive, hormonal, and genetic factors. However, the most important risk factor is genetic predisposition or susceptibility, which is responsible for 5-15% of all BC cases. In 1994 and 1995, the BRCA1 and BRCA2 genes were discovered, which have been considered high penetrance susceptibility genes. BRCA1 and BRCA2 mutations are responsible for 16-20% of the familial risk for BC. It has been proposed that other susceptibility genes of moderate and low penetrance might be responsible for the remaining 80% of cases with BRCA1/2-negative familial BC. Mutations in the BRCA1 gene are responsible for approximately 54% of the risk of developing BC. Several studies have shown that BRCA1 expression is regulated by miRNAs. Between 20-100 miRNAs have been predicted to bind to the 3'UTR of BRCA1 mRNA. One of the miRNAs that target the 3'UTR of the BRCA1 mRNA is miRNA-182. The literature has suggested that miRNA-182 is an oncogenic miRNA involved in the progression of malignant tumors, promoting the proliferation and migration of cancer cells. The group of Moskwa et al. (2011) demonstrated that miRNA-182 targets the 3'UTR of the BRCA1 mRNA and that high miRNA levels decrease BRCA1 expression. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most common type of variation in the human genome. SNPs in miRNA genes can affect: the processing and maturation of the miRNA, or the interaction of the miRNA with the target mRNA. Association studies have been carried out between miRNA polymorphisms and BC risk. Recent studies identified the SNP rs4541843: C> T, which is located in the region of pri-miRNA-182. Morales et al. (2018) established that the variant rs4541843: C> T in the pri-miR-182 is associated with the risk of familial BC in the Chilean population. In this thesis, we proposed to evaluate the effect of rs4541843: C> T on mature miRNA-182 levels and the binding of miRNA-182 to BRCA1 mRNA. For this, mature miRNA-182 levels of both rs4541843 T and C alleles were evaluated by RT-qPCR. To determine the effect of the SNP rs4541843: C> T on the binding of miRNA-182 to the 3'UTR of BRCA1 mRNA, a luciferase assay was performed. The results showed that in the BC cell lines higher levels of the 3p strand of the mature miRNA-182 transfected with the primiRNA- 182-C were observed, compared to those transfected with the T allele. Furthermore, this occurs in the presence of the C allele of rs4541843, which suggests that the C allele of this SNP is the risk allele. Results also indicated a significant increase in the binding of miRNA-182 to the 3'UTR region of the mRNA of BRCA1 when cells are transfected with the C allele of the SNP rs4541843, compared to those transfected with the empty vector. This allows us to conclude that the C allele of rs4541843: C> T of the pri-miRNA-182 is the risk allele. These results are important for BRCA1/2-negative patients, since they might present very low levels of BRCA1 protein and be equivalent to patients with germline BRCA1 mutations if they are carriers of C variant in pri-miRNA-182. Therefore, genetic variations within the pri-miRNA-182 could explain part of the presence of BC in patients whose genetic etiology has not yet been established