El fragmento C-terminal del factor de crecimiento de fibroblástico 23 (FGF23) es una proteína de 19 kDa que circula en plasma humano

Abstract

El Factor de Crecimiento Fibroblástico 23 (FGF23) es una hormona peptídica de 251 aminoácidos. Su principal función es modular la homeostasis del fosfato, inhibiendo la reabsorción de fosfato en el túbulo proximal del riñón produciendo una disminución de la fosfatemia. Estudios muestran que los niveles plasmáticos de FGF23 aumentan en daño renal, para mantener estables los niveles de fosfato sanguíneo a medida que el riñón pierde su función. Este aumento en la concentración plasmática de la proteína se correlaciona en forma positiva con mayor mortalidad. Se ha demostrado que existen distintas isoformas de FGF23 circulantes en plasma: una forma intacta (iFGF23) y una forma C-terminal (cFGF23). En la literatura se describe un corte en una secuencia altamente conservada 176RHTRSAE182 que formaría un fragmento C-terminal de 72 aa. Sin embargo, este fragmento no es concordante con el fragmento C-terminal de aproximadamente 14 kDa descrito en diversas investigaciones anteriores. El objetivo de esta memoria es reconocer en muestras de plasma humano, iFGF23 y cFGF23 en condiciones normales y en pacientes con daño renal, avanzando en la caracterización de este fragmento. Para este trabajo, se utilizó la técnica de inmunodetección de Western Blot, con la cual se detecta FGF23 en el plasma sanguíneo de pacientes en enfermedades crónicas de riñón y pacientes sanos. Para lograr este objetivo se utilizaron anticuerpos dirigidos a distintos epítetos de la proteína, un anticuerpo hacia su porción N-terminal y dos anticuerpos hacia la porción C-terminal. Los resultados muestran la detección de una molécula de alrededor de 25 kDa, la cual es reconocida por todos los anticuerpos. Además, las bandas varían en intensidad, lo que se interpreta como una diferencia en sus cantidades relativas, las cuales se correlacionan con el daño renal presentado en los pacientes. Esto sugiere que la molécula que se reconoce es iFGF23. Por otro lado, también se observan bandas alrededor de los 19 kDa. Estas bandas demuestran la presencia de un fragmento C-terminal que posee tanto el segmento de unión a Klotho, un cofactor obligado para la activación del FGFR, reconocido por el anticuerpo C-terminal 186-206 y la cola C-terminal que es reconocida por el anticuerpo 225-244. Según el peso descrito para la cadena aminoacídica de la molécula, este fragmento C-terminal contiene gran parte de la zona de homología a FGF, pero no completa; por lo tanto, se podría estimar que no es biológicamente activo, siendo incapaz de activar al receptor FGFR. Sin embargo, aún faltan estudios de funcionalidad para confirmar esta propiedad. Estos resultados nos permiten concluir que es factible detectar la presencia de FGF23 por medio de un ensayo de Western Blot en muestras de plasma humano. Además, en este trabajo se reporta la presencia de un fragmento C-terminal de 19 kDa no descrito previamente. Esta molécula podría corresponder al fragmento que se encuentra circulando en el plasma en conjunto con iFGF23. Para caracterizar estos péptidos se requieren estudios de espectrometría de masas y de funcionalidad para determinar la importancia de este péptido de 19 kDa en la patología renal crónica

Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) is a peptide hormone of 251 amino acids. Its main function is to modulate phosphate homeostasis, inhibiting phosphate reabsorption in the proximal tubule of the kidney, producing a decrease in phosphatemia. Studies show that plasma levels of FGF23 increase in kidney damage to maintain stable blood phosphate levels as the kidney loses its function. This increase in plasma concentration of the protein is positively correlated with higher mortality. It has been shown that there are different isoforms of FGF23 circulating in plasma: an intact form (iFGF23) and a C-terminal form (cFGF23). The literature describes a cut in the highly conserved sequence 176RHTRSAE182 that is predicted to form a C-terminal fragment of 72 aa. However, this fragment is not consistent with the C-terminal fragment of approximately 14 kDa described in various former investigations. The objective of this work is to identify iFGF23 and cFGF23 in raw human plasma samples in patients with kidney damage and patients with normal kidney function, advancing in the characterization of this fragment. For this work, the Western Blot immunodetection technique was used, in which FGF23 is detected in the blood plasma of chronic kidney disease patients and healthy patients. For this, antibodies directed to different epithets of the protein were used, one antibody that recognizes its N-terminal portion and two antibodies that bind to the C-terminal portion. All the antibodies where able to recognize a molecule of around 25 kDa, the bands also vary in intensity, this is interpreted as a difference in their relative amounts, which correlate with the renal damage presented in patients. This suggests that the molecule being recognized is iFGF23. On the other hand, bands of around 19 kDa are also observed. These bands reveal the presence of a C-terminal fragment that includes both the Klotho-binding segment, a cofactor for the FGFR activation, recognized by the C-terminal antibody 186-206, and the C-terminal tail that is recognized by the 225-244 antibody. According to the weight predicted by the amino acid chain of the molecule, this C-terminal fragment contains a large portion, but not the complete sequence of homology to FGF. Therefore, it is predictable that this fragment is not biologically active, being incapable of activating the FGFR receptor. However, functionality studies are still lacking to confirm or reject this possibility. These results allow us to conclude that it is feasible to detect the presence of FGF23 by means of a Western Blot assay in human plasma samples. In addition, a 19 kDa C-terminal fragment is recognized that had not been described previously. This molecule might be the fragment found in plasma together with iFGF23. To characterize more deeply the properties of this fragment, mass spectrometry analysis and functionality studies are required to describe the importance of this 19 kDa molecule