Participación del receptor tipo Toll-4 en la secreción de citoquinas proinflamatorias mediada por hemocianinas de moluscos en células presentadoras de antígenos murinas

Abstract

Las hemocianinas son glicoproteínas de gran tamaño presentes en la hemolinfa de algunos moluscos, utilizadas ampliamente con fines clínicos en el desarrollo de vacunas experimentales y en la inmunoterapia de ciertos cánceres, así como en aplicaciones biotecnológicas como transportadores (carrier) en la producción de anticuerpos contra péptidos y moléculas de hapteno. Estas glicoproteínas son capaces de activar al sistema inmune, actuando como inmunoestimulantes no específicos que direccionan la respuesta inmune en mamíferos hacia un perfil T helper 1 (Th1), conociéndose escasamente cómo desarrollan dicha respuesta. Nuestro laboratorio ha mostrado que, durante la respuesta inmune innata, las hemocianinas interaccionan con algunos receptores de reconocimiento de patrones asociados a patógenos (PRRs) que se expresan en células presentadoras de antígeno (APCs), cuya interacción es dependiente de glicosilaciones. Entre estos receptores se encuentran algunos de la familia de las lectinas tipo-C, como el receptor de manosa (MR), DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin), MGL (macrophage galactose-type lectin) y de la familia de recetores Toll, como el receptor Toll-like 4 (TLR4). Estos receptores están involucrados en la endocitosis de las hemocianinas de Concholepas concholepas (CCH), Fissurella latimarginata (FLH) y Megathura crenulata (KLH), vía sus residuos oligosacáridos ricos en manosa, enviándolas a compartimentos subcelulares donde son procesadas y presentadas por antígenos de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) a linfocitos T CD4+. Sin embargo, datos preliminares muestran que también podrían seguir una vía alterna de presentación a linfocitos T citotóxicos CD8+, conocida como presentación cruzada, la cual sería relevante en la respuesta antitumoral generada por las hemocianinas. En la presentación cruzada, es determinante la interacción de ligandos con receptores de inmunidad innata como el MR, que se asocia con otros receptores porque no tiene motivos de señalización, entre ellos TLR4, para inducir la liberación de citoquinas proinflamatorias. Se ha utilizado el silenciamiento génico para identificar la función que ejerce TLR4 en APCs, sin embargo, la interacción de las hemocianinas con APCs en ausencia de este receptor no se ha estudiado. Por esta razón, en esta Tesis se decidió evaluar el efecto proinflamatorio de las hemocianinas y la presencia de TLR4 en un modelo celular con altos niveles de expresión de este receptor y que además, indujera niveles significativos de citoquinas para un análisis posterior utilizando un siRNA anti-TLR4, proponiendo la siguiente hipótesis: “El silenciamiento génico de TLR4 mediado por un siRNA y Lipofectamina en células presentadoras de antígeno murinas, disminuirá significativamente la secreción de citoquinas proinflamatorias inducida por hemocianinas”. Con este propósito, primeramente, se determinó la presencia de TLR4 mediante citometría de flujo en la línea celular de macrófagos murinos J774.2 y en un cultivo primario de macrófagos derivados de médula ósea de ratón (BMDMs). Se encontró altos niveles de expresión en la línea celular (~ 70%) y bajos niveles (~30%) en las BMDMs. Además, se evaluó la respuesta proinflamatoria inducida por las hemocianinas CCH y FLH en ambos tipos celulares, observando niveles significativos de IL-6 a 0,1 mg/ml de FLH y 0,5 mg/ml de CCH en la línea celular, y una tendencia al alza de IL-6, IL-12p40 y TNF con FLH a 2,0 mg/ml en las BMDMs a las 24 horas. Posteriormente, se diseñó un protocolo de silenciamiento génico de TLR4 mediante un siRNA y Lipofectamina para ambos tipos celulares. cuyos resultados -que incluyeron qPCR y citometría de flujo para determinar la expresión de TLR4- mostraron una baja eficiencia de silenciamiento inclusive utilizando altas concentraciones de siRNA. Los resultados obtenidos permiten concluir qué, las transfecciones realizadas en la línea J774.2 mediante Lipofectamina y siRNA para TLR4, mostraron resultados variables y poco eficientes para inhibir la expresión de TLR4 y, qué dada su baja expresión y la ineficacia de la transfección en las BMDMs, se concluyó que ambos tipos celulares no son buenos modelos de estudio para poder evaluar el efecto de las hemocianinas en células presentadoras de antígeno en ausencia de este receptor. Finalmente, es importante señalar que, como proyección de esta Tesis, se propone explorar otros sistemas, como podría ser el silenciamiento de TLR4 vía CRISPR-Cas9 y utilizar las líneas JAWSII de células dendríticas y THP-1 de macrófagos humanos

Hemocyanins are large glycoproteins present in the hemolymph of some mollusks, widely used for clinical purposes in developing experimental vaccines and in the immunotherapy of certain cancers, and biotechnological applications as a carrier in the production of antibodies against peptides and hapten molecules. When inoculated in mammals, these glycoproteins can activate the immune system, acting as non-specific immunostimulants that direct the immune response towards a T helper 1 (Th1) profile, although how this response develops is poorly understood. Our laboratory has shown that to induce this response, the hemocyanins interact with some innate immunity receptors expressed on antigen presenting cells (APCs), whose interaction is glycosylation-dependent. Among these receptors are some of the C-type lectin family, such as the mannose receptor (MR), DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin), and macrophage galactose-type lectin (MGL), as well as the Toll-like receptor 4 (TLR4) belonging to the Toll family. These receptors are involved in the endocytosis of hemocyanins from Concholepas concholepas (CCH), Fissurella latimarginata (FLH), and Megathura crenulata (KLH), via their mannose-rich oligosaccharide residues, sending them to subcellular compartments where they are processed into histocompatibility class II antigens (MHC-II) and presented to CD4+ T lymphocytes. However, preliminary data show that they could also follow an alternative presentation pathway to CD8+ cytotoxic T lymphocytes, known as cross-presentation, which would be relevant in the antitumor response generated by hemocyanins. In cross-presentation, the interaction of ligands with innate immunity receptors such as MR, which associates with other receptors because it has no signaling motifs, including TLR4, to induce the release of proinflammatory cytokines, is decisive. Gene silencing has been used to identify the function exerted by TLR4 on APCs; however, the interaction Thesis it was decided to evaluate the proinflammatory effect of hemocyanins and the presence of TLR4 in a model expressing high levels of the receptor and inducing significant levels of cytokines for subsequent analysis with an anti-TLR4 siRNA. First, the presence of the TLR4 receptor was determined by flow cytometry in a J774.2 macrophage cell line and a primary culture of mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs), finding high levels in the cell line ~70% and low levels in the BMDMs ~30%. In addition, the proinflammatory response induced by CCH and FLH was evaluated in both cell types, achieving significant levels of IL-6 at 0.1 mg/ml of FLH and 0.5 mg/ml of CCH in the cell line, and an upward trend of IL-6, IL-12p40, and TNF with FLH at 2.0 mg/ml in the primary culture. Subsequently, a TLR4 gene silencing protocol was designed using siRNA and Lipofectamine for the J774.2 cell line and BMDMs. The results obtained in this Thesis indicate that the transfections performed in both cell types are not efficient when transfected with Lipofectamine even at high siRNA concentrations. Finally, it is important to point out that, as a projection of this Thesis, we proposed exploring other systems, such as the silencing of TLR4 via CRISPR-Cas9 and using the JAWSII lines dendritic cells and THP-1 of human macrophages