Estudio de la expresión de genes de la carotenogénesis en Xanthophyllomices dendrorhous (ex Phaffia rhodozyma)

Abstract

La astaxantina (3, 3´-dihidroxi-,  caroteno-4, 4´ diona) es un pigmento carotenoide con reconocidas propiedades antioxidantes sintetizado por la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous. Los genes que codifican para las enzimas involucradas en la biosíntesis de astaxantina en esta levadura han sido clonados y secuenciados. Dichos genes incluyen al idi (isopentenil pirofosfato isomerasa), crtE (geranilgeranil pirofosfato sintasa), crtYB (fitoeno--caroteno sintasa), crtI (fitoeno desaturasa) y ast (astaxantina sintetasa). Si bien en otros organismos carotenogénicos eucariotas existen numerosos trabajos a cerca de la expresión de los genes de carotenogénesis, en X. dendrorhous no había hasta el momento información al respecto. En esta tesis se estudió la correlación entre la producción de carotenoides y la expresión de los genes de carotenogénesis a nivel de sus mRNAs. Utilizando RT-PCR, se clonaron y secuenciaron dos tipos distintos de cDNAs del gen crtI. Uno de ellos, fue sintetizado a partir de un mRNA con todos sus intrones procesados en forma correcta, por lo cual este mRNA maduro se traduciría a la proteína fitoeno desaturasa activa. El otro cDNA se sintetizó a partir de un mRNA que conservó 80 bases del primer intrón. Este mensajero, denominado alternativo, sería procesado en un sitio 3´ de ‘splicing’ alternativo (AG) no habitual. La traducción del mensajero alternativo genera codones de término de la traducción a lo largo de toda la secuencia, por lo cual no sería traducido a una proteína fitoeno desaturasa activa. De igual forma, se aislaron tres cDNAs distintos para el gen crtYB. Uno de los cDNAs fue sintetizado a partir del mRNA maduro y por lo tanto sería xiii traducido a la proteína fitoeno--caroteno sintasa activa. Sin embargo, el segundo cDNA tenía todos los intrones y por consiguiente, fue sintetizado a partir de un preRNA. El tercer cDNA se sintetizó a partir de un mensajero que había conservado 55 bases del primer intrón y había perdido 111 bases del segundo exón. Este mensajero, también denominado alternativo, sería procesado dentro del primer intrón en un sitio 5´ de ‘splicing’ (GT) no esperado y dentro del segundo exón en un sitio 3´ de ‘splicing’ (AG) alternativo. La traducción de este mensajero, genera como en el caso del mensajero alternativo del gen crtI, codones de término de la traducción prematuros. El análisis de la expresión de los mensajeros crtI y crtYB alternativos y maduros indica que se sintetizan con niveles variables a lo largo del ciclo de vida tanto en la cepa silvestre UCD 67-385 como en una cepa sobreproductora denominada atxS2. Con respecto al gen crtI, se observó que la proporción mensajero maduro/mensajero alternativo disminuye a lo largo del ciclo de crecimiento de la levadura. Es posible que la síntesis de mensajeros alternativos sea una forma de regular la síntesis de las proteínas de carotenogénesis. La comparación de los primeros intrones de los genes de la fitoeno desaturasa entre X. dendrorhous y ascomicetes, indicaría que este grupo de hongos no tendría la forma de ‘splicing’ descrita en este trabajo, puesto que carecen de los sitios de ‘splicing’ alternativo. Un análisis similar con el gen que codifica la fitoeno-- caroteno sintasa nos permitió arribar a la misma conclusión. Hasta el momento no se ha descrito ‘splicing’ alternativo en genes de carotenogénesis de otros organismos. Con respecto a la síntesis de carotenoides, se observó que en la cepa UCD 67- 385 la síntesis se induce al finalizar la fase exponencial de crecimiento. En la cepa mutante atxS2, la concentración celular de carotenoides es 4 veces más alta que en la xiv cepa silvestre durante la fase exponencial de crecimiento. Por consiguiente, la síntesis de carotenoides en la mutante está desregulada desde el inicio del ciclo de crecimiento. En relación con la expresión de los genes que codifican para las enzimas de carotenogénesis en la cepa UCD 67-385, los niveles de los mensajeros fueron máximos durante el período de inducción de la síntesis de carotenoides. Sin embargo, los niveles de los mensajeros crtYB, crtI, ast e idi, en menor medida, disminuyeron sus niveles al finalizar la fase exponencial de crecimiento. Con respecto al nivel del mRNA del gen crtE, el mismo se mantuvo elevado durante el período diauxia-fase estacionaria. Por otra parte, en la cepa atxS2 los niveles de los mensajeros crtE, crtI y ast son alrededor de 2 veces el nivel que se encuentra en la cepa silvestre en una etapa temprana del ciclo de crecimiento. El nivel del mRNA del gen ast en la cepa atxS2 también es más elevado que en la cepa silvestre durante la fase estacionaria. Estos resultados podría explicar al menos parcialmente, la mayor producción de carotenoides en la cepa mutante.

Astaxanthin (3, 3´-dihydroxy-,  carotene-4, 4´-dione) is a carotenoid pigment with well-known antioxidant properties which is synthesized by the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous. The genes controlling the astaxanthin biosynthesis in X. dendrorhous have been isolated. The cloned and sequenced genes include: idi (isopentenyl pyrophosphate isomerase), crtE (geranylgeranyl pyrophosphate synthase), crtYB (phytoene--carotene synthase), crtI (phytoene desaturase) and ast (astaxanthin synthetase). There are several studies on the expression of carotenogenic genes in eukaryotes. In this thesis the production of carotenoids in X. dendrorhous was studied in relation to the expression of carotenogenic genes at the mRNA level as in this yeast there are no studies about the carotenogenic transcripts or proteins levels. Two different cDNAs of the crtI gene were cloned and sequenced using RTPCR. One of them corresponded to the mature mRNA of the crtI gene as it has no intervening sequences and thus, it could be translated to active phytoene desaturase protein. The other cDNA was synthesized from a transcript which conserved 80 bases of the first intron. This transcript, named alternative, would follow an alternative splicing pathway using an anusual 3´ splice site (AG). Nucleotide sequence translation of this messenger produces premature stop codons and therefore it would not be translated to the phytoene desaturase protein. Similarly, three different cDNAs were amplified using RT-PCR with specific primers for the crtYB gene. The sequence analysis of these cDNAs indicated that one of them corresponded to the mature transcript as it had no intervening sequences. However, xvi the second cDNA had all the intervening sequences and therefore it was synthesized from a pre-RNA. The third cDNA corresponded to a mRNA which had conserved 55 bases of the first intron and had lost 111 bases from the second exon. This alternative mRNA could have followed an alternative splicing pathway using an unexpected 5´ splice site inside the first intron and an unexpected 3´ splice site inside the second exon. As it was stated with the crtI alternative mRNA, nucleotide sequence translation of the crtYB alternative mRNA produces premature stop codons. In addition, mature and alternative transcripts of both crtI and crtYB genes are detected with varying levels along the yeast growth cycle in the wild-type strain UCD 67-385 and in the astaxanthin over-producing strain atxS2. The ratio of mature messenger/alternative transcripts of the crtI gene diminished along the yeast life cycle. It is possible that the synthesis of alternative mRNAs could be a way to regulate the concentration of carotenogenic proteins. On the other hand, the sequence comparison of the first intron of the phytoene desaturase gene among X. dendrorhous and ascomycetous fungi, suggests that the RNA of that gene in ascomycetes would not follow an alternative splicing pathway as described in X. dendrorhous because they lack the alternative splice sites. The same conclusion was obtained after performing a similar analysis with the phytoene- -carotene synthase gene from fungi. As far as we know, alternative splicing has not been reported in carotenogenic genes before. The carotenoid biosynthesis is induced after finishing the exponential phase of the growth cycle in the UCD 67-385 strain. In the atxS2 strain, the cellular concentration of carotenoids is four times greater than in the wild-type strain during the exponential phase of the growth cycle, and thus, the mutant is deregulated for xvii carotenoid production. With regard to the carotenogenic gene expression, the highest mRNA levels in the wild-type strain were during the induction period of carotenoid biosynthesis. However, the mRNA level of the crtYB, crtI and ast genes, and to a lesser extent the idi gene, diminished after the exponential phase of the growth cycle. With respect to the crtE gene, its mRNA level remained high after the exponential phase. In strain atxS2, mRNA levels of crtE, crtI and ast genes were approximately two times higher than in the wild-type strain in an early culture time of the growth cycle. In addition, the mRNA level of the ast gene is higher in the atxS2 strain than in the wild-type strain during stationary phase. These results could partially explain the increased carotenoid production by the mutant strain.