Estudio de la distribución subcelular de la enzima metionina sulfóxido reductasa de Caenorhabditis elegans

Abstract

El daño oxidativo inducido por las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los diferentes componentes celulares se ha postulado como una de las principales consecuencias del envejecimiento celular y de enfermedades crónicas asociadas a la edad. Durante el envejecimiento este daño oxidativo está caracterizado por la oxidación de lípidos, ADN y proteínas. En las proteínas el blanco principal de las ROS corresponde a aquellos aminoácidos sulfurados como la Metionina y la Cisteína, existiendo sólo para el caso de la Metionina un sistema de reparación específico para los isómeros de su forma oxidada; la enzima Metionina Sulfóxido Reductasa (Msr). Esta enzima es altamente conservada y se expresa desde las bacterias a los mamíferos. Su función fisiológica se ha relacionado con la mantención de la actividad de proteínas afectadas por la oxidación de algunas de sus metioninas. Recientemente en el caso de la Msr del tipo A, ésta ha sido involucrada en los procesos que determinan la vida media de los organismos. En Caenorhabditis elegans se determinó su secuencia genómica, su actividad enzimática y su expresión en los diferentes tejidos de estos organismos, sin embargo, aún se desconoce su distribución subcelular y su función biológica en los diferentes tejidos. En este trabajo se propone como hipótesis que la Metionina Sulfóxido Reductasa de C. elegans (MSRA-1) presenta una distribución mayoritariamente mitocondrial, y su función enzimática está ligada a la reparación del daño provocado por el estrés oxidativo generado en este organelo. En una primera etapa se estudió la distribución subcelular de la MSRA-1 de C. elegans expresada en cultivo de líneas celulares de mamíferos. Para lo cual se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia indirecta, microscopia fluorescente, fraccionamiento subcelular y de microcopia electrónica de transmisión (MET). Nuestros resultados indican que la MSRA-1 presenta una distribución prioritariamente mitocondrial cuando es expresada en diferentes líneas celulares en cultivo. En una segunda etapa, se estudió la estructura y secuencia aminoacídica del extremo N-terminal de esta proteína en busca de una posible señal de destinación mitocondrial, homóloga a las reportadas en la literatura. Este análisis determinó la existencia de dos Argininas (R6 y R30) cercanas al N-terminal de la MSRA-, las que presentan similitud en su posición a las Argininas de relevancia para la distribución subcelular presente en otras especies. Se generaron dos construcciones génicas donde se eliminaron los fragmentos del extremo N-terminal de la enzima que contenían estas Argininas (10 aminoácidos). Sin embargo, los resultados mostraron que los cortes efectuados en la secuencia afectaron la expresión de la enzima. Posteriormente estudios con una mutante específica para la Arginina 6, sugieren que esta mutante presenta una pérdida de la destinación mitocondrial. Finalmente, se observó in vivo la expresión de la MSRA-1 en C. elegans y su papel fisiológico, rescatando el fenotipo de la cepa mutante con la expresión de esta enzima.

The oxidative damage induced by the reactivate oxygen species (ROS) in different cellular components has been postulated as one of the main consequences of cellular aging and of chronic diseases associated with age. During aging oxidative damage is characterized by the oxidation of lipids, DNA and proteins. In proteins, the main target of ROS are methionine and cysteine amino acid residues. The oxidation of methiones, unlike other oxidative modifications, can be reduced by the methionine sulfoxide reductase system (Msr). MsrA is a well characterized component of this system and is a conserved enzyme found from bacteria to mammals. Its function has been related to the maintenance of activity of proteins affected by the oxidation of some methionines, moreover, lately and specifically the MsrA, has been involved in the processes that determine the lifespan. Recently, MSRA-1 in Caenorhabditis elegans has been sequenced and its enzymatic activity has been characterized, however its biological function and subcellular localization are unknow. In this work our hypothesis is that the Methionine Sulfoxide Reductase of C. elegans (MSRA-1) is expressed mainly in mitochondria and its enzymatic function would be the repair of the oxidative stress damage generated in this organelo. In the first stage, we studied the subcellular distribution of the MSRA-1 expressed in different mammalian cell culture lines. For this purpose we used immunofluorescence hint, fluorescent microscopy, mitochondrial isolation and electronic microcopy of transmission (EMT). Cell cultures lines were transfected with constructions that express the MSRA-1 enzyme fused to epitopes as myc or GFP. Our results indicate that MSRA-1 mainly is distributed in mitochondria when the protein is expressed in Hela and Hek293T cells. In the second stage, we analyzed the secondary structure and aminoacid sequence of the N-terminus of this enzyme. The results of this study show that two arginines (R6 and R30) located the N-terminus of the MSRA-1 are relevant for the mitochondrial destination. These arginines are conserved in position and relevance for other species. Finally, we analyzed in vivo the MSRA-1 expression in C. elegans and his physiological role, with the rescue of phenotype in mutant strain.