Fas-l promueve muerte celular en células linfoides vía liberación de ATP y activación de receptores p2x7

Abstract

Entre los receptores de muerte celular, se describe al receptor Fas en células linfoides como un receptor que activa tanto apoptosis como necrosis. Recientemente se ha asociado la inducción de apoptosis con la salida de ATP vía hemicanales formados por panexina-1 en linfocitos. Por otra parte, muchas evidencias señalan al ATP extracelular como mediador de muerte celular, tanto por necrosis como por apoptosis, identificándose al receptor purinérgico P2X7 como receptor de muerte, el que tiene como único ligando biológico al ATP. En este contexto, en esta Tesis, se determinó que las células A20 (derivadas de linfocitos B de ratón) y Jurkat (derivadas de linfocitos T humanos), pero no Ramos, Raji (derivadas de linfocitos B humanos) y A20R (derivadas de linfocitos B de ratón) son sensibles a FasL. En células Jurkat el tipo de muerte celular que predominó fue la apoptosis, en cambio en A20 fue la necrosis. Solo las células Jurkat liberaron ATP en forma significativa de manera tiempo dependiente en respuesta a estimulación con FasL y no se obtuvo evidencia de daño en la membrana plasmática. En estas células la liberación de ATP fue inhibida por zVAD (inhibidor general de caspasas) y z-IETD (inhibidor de caspasa 8), pero no por zDEVD (inhibidor de caspasa 3). Además, la pre-incubación con inhibidores de hemicanales formados por panexinas (carbenoxolona y probenecid), pero no de hemicanales formados por conexinas (heptanol) también inhibió la liberación de ATP en respuesta a FasL. Por otra parte, en las células Jurkat los inhibidores de los receptores P2X7, oATP y BBG, inhibieron la muerte celular por apoptosis, en cambio los inhibidores de esfingomielinasas (miriocina, imipramina y GW4869) no protegieron a estas células al estimularlas con FasL. En células A20, oATP y el inhibidor de esfingomielinasa neutra (GW4869) mostraron un efecto protector al inhibir la muerte por necrosis inducida por FasL. Además, se apreció un efecto protector en la muerte por apoptosis al pre-tratar estas células con suramina. En ambos tipos celulares el tratamiento con N-acetilcisteína bloqueó la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por FasL. Estos resultados representan la primera evidencia de que se produce una cooperación entre dos receptores de muerte celular, Fas y P2X7, en la ejecución de la muerte celular en células linfoides. Frente al mismo estímulo en células A20 y Jurkat, el tipo de muerte celular y los mecanismos involucrados son en parte distintos. En células A20, FasL gatilla muerte celular por necrosis, que podría involucrar la participación de otros receptores P2X distintos a P2X7. En cambio, en las células Jurkat la activación del receptor Fas por FasL lleva, por una parte a la activación de caspasa-8 y posteriormente, a la activación de la caspasa-3. Por otro lado, la liberación de ATP activada por caspasa-8 sería mediada por hemicanales formados por panexina-1. Esto a su vez llevaría a la activación del receptor P2X7, que gatillaría la muerte celular por apoptosis en un mecanismo que podría involucrar la participación de ROS. Esto es un hallazgo importante, ya que en las células Jurkat, que son células tipo II, además de tBID, liberan ATP vía hemicanales formados por panexina-1 lo que también contribuiría a la amplificación de la vía intrínseca de la apoptosis mediante la activación del receptor P2X7.

Fas has been described in lymphoid cells as a death receptor capable of inducing both apoptosis and necrosis. More recently, the induction of lymphocyte apoptosis has been associated with the release of ATP via pannexin-1. Additionally, ATP is implicated as a mediator of cell death by both necrosis and apoptosis, via the purinergic receptor P2X7 whose only know biological ligand is ATP. To date no evidence is available indicating that FasL-induced cell death requires activation of P2X7 via liberation of ATP. In this Thesis, we determined that A20 and Jurkat but not Ramos, Raji and A20R cells were sensitive to FasL. In Jurkat cells death by apoptosis predominated, whereas in A20 necrosis was more prevalent. Only for Jurkat cells did we observe ATP release in a time-dependent manner in response to FasL without any evidence of damage to the plasma membrane as assessed by measuring LDH release. In these cells, ATP release was inhibited by zVAD (general caspase inhibitor) and z-IETD (inhibitor of caspase 8), but not zDEVD (inhibitor of caspase 3). Furthermore, pre-incubation with inhibitors of pannexin (carbenoxolone and probenecid), but not connexin (heptanol), also inhibited ATP release in response to FasL. Moreover, in Jurkat cells the P2X7 inhibitors oATP and BBG inhibited cell death by apoptosis, whereas inhibitors of sphingomyelinases (miriocina, imipramine and GW4869) did not protect these cells. In A20 cells, oATP and to a lesser extent the neutral sphingomyelinase inhibitor (GW4869) protected against FasL-induced necrosis. Pre-treating these cells with suramin also reduced death in both cell types (Jurkat, A20). Also, N-acetylcysteine protected efficiently against FasL-induced death by blocking the generation of reactive oxygen species (ROS). These results represent the first evidence indicating that the two death receptors, Fas and P2X7, collaborate to promote cell death in lymphoid cells. In A20 and Jurkat cells, the type of cell death and the mechanisms involved were somewhat different. In A20 cells, FasL triggers cell death mainly by necrosis, which may involve the participation of P2X receptors other than P2X7. In contrast, in Jurkat cells the activation of Fas by FasL leads to the activation of caspase-8 and subsequently caspase-3. Additionally, caspase-8 promotes release of ATP- through pannexin-1 channels. This in turn is suggested to lead to the activation of P2X7, which triggers cell death by apoptosis via a mechanism that may involve ROS. Jurkat cells are type II cells where caspase-8 dependent cleavage of BID to tBID and activation of the intrinsic mitochondrial branch is required for successful execution of apoptotic cell death. Thus the relevance of our finding resides in uncovering a new connection downstream of caspase-8 to the intrinsic pathway involving pannexin-1 mediated ATP release and P2X7 activation.