Regulación de NFkB por especies reactivas de oxígeno y calcio en neuronas hipocampales

Abstract

La actividad de las neuronas produce un aumento en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y también en la concentración de calcio intracelular, así como una mayor actividad en el factor transcripcional Factor Nuclear derivado de Linfocito B (NFBB). Se ha demostrado que los ROS, moléculas habitualmente asociadas a daño celular, ejercen un rol importante en la transducción de señales a concentraciones bajas, mientras que un desbalance en el equilibrio de los mecanismos prooxidativos y antioxidantes es el responsable de sus efectos tóxicos. La participación del calcio en la actividad neuronal ha sido ampliamente documentada, siendo clave en los mecanismos involucrados en plasticidad sináptica. La relación entre calcio y ROS ha sido estudiada en varios modelos celulares. Numerosos resultados experimentales sugieren que la generación de ROS está regulada por los niveles de calcio, ya sea de forma positiva o negativa. Similarmente, los niveles de calcio intracelular dependen de las condiciones oxido reductoras de las proteínas participantes en esa regulación. Por otro lado, el funcionamiento de muchas moléculas depende de su regulación por calcio y por ROS. El factor transcripcional NFBB, compuesto de varias subunidades como p65 y p50, cumple amplias funciones en distintos tipos celulares, especial relevancia cobra en células del sistema inmune, principalmente en el fenómeno de la respuesta inflamatoria y antimicrobiana. En neuronas, se ha observado una mayor actividad de p65, la cual participa en los mecanismos de plasticidad sináptica relacionados con aprendizaje y memoria. El objetivo principal de esta memoria fue investigar la relación cruzada entre especies reactivas de oxígeno y el calcio intracelular en la activación de NFBB en neuronas hipocampales activadas por despolarización con estímulo eléctrico de campo. Para demostrarlo se determinó la generación de ROS con el plasmidio HyperCyto, el cual fluorece ante la presencia de H2O2. Para asociar dichos cambios con variaciones en los niveles de calcio se uso la sonda fluorescente FuraRed AM. A su vez se analizaron cambios en la distribución celular (citosol - núcleo) de la proteína de fusión eGFP-p65. En este trabajo se mostró que la estimulación eléctrica de campo, a frecuencias de 10 y 50 Hz, produce generación de ROS asociado a un aumento en la concentración de calcio intracelular, fenómenos asociados a la traslocación al núcleo de la subunidad p65 de NFBB. También se observó que el aumento de ROS no fue afectado en forma sustancial cuando las células fueron estimuladas en medio de reposo sin calcio o en presencia del quelante intracelular de calcio BAPTA sugiriendo que el calcio proveniente del medio extracelular no tiene un rol relevante en la generación de ROS mediada por el estímulo eléctrico. En contraste, se observó una disminución total en la generación de ROS en presencia de ryanodina, en concentraciones inhibitorias del canal de calcio receptor de ryanodina. El aumento de calcio intracelular no fue afectado en células estimuladas eléctricamente previamente incubadas con DPI, un inhibidor general de flavoproteínas como las NADPH oxidasa, una enzima generadora de ROS. Además se demostró que la traslocación de p65, provocada por la estimulación eléctrica de campo, era atenuada totalmente en células que habían sido incubadas antes, durante y después del estimulo con ryanodina, en concentraciones inhibitorias de la activación del canal de calcio receptor de ryanodina, y con N-acetil-cisteína, una molécula con alta actividad antioxidante. También se observó que estos fenómenos tienden a repetirse al estimular a las neuronas con un menor número de pulsos o a una menor frecuencia. Estos resultados, sumados a nuevos experimentos con DPI, muestran que la regulación entre calcio y especies reactivas de oxígeno también se da en este modelo experimental. Debemos agregar que esta conversación cruzada está involucrada en la migración al núcleo de NFBB, particularmente tras el estímulo despolarizante de las neuronas. Los experimentos aquí mostrados permiten postular que la principal fuente de calcio participante parece ser el retículo a través de su canal de calcio receptor de ryanodina, además la metodología empleada, mediante el uso de una sonda específica, permiten individualizar la presencia de H2O2 en los procesos descritos en este trabajo.

Physiological activity in neurons shows an increase in reactive oxygen species (ROS) generation, intracellular calcium concentration and the transcriptional factor NFBB among other parameters. It has been demonstrated that ROS, which is usually associated to cellular damage, has an important role at low concentration in signal transduction cascades, while an equilibrium imbalance between the prooxidants and antioxidants mechanism is the responsible for their toxicity at higher concentration. The calcium participation in neuronal activity is well documented; calcium has key functions in the mechanisms involved in synaptic plasticity. The correlation between calcium and ROS has been deeply studied in several models, they point to ROS generation as being up or down-regulated by the intracellular calcium level. On the other hand, the intracellular calcium level depends on calcium regulating oxidative state of proteins. Besides, the function of various molecules requires the presence of calcium and ROS. NFBB has been assigned several functions in different cellular types, such as its role in the immune system, mainly in the inflammatory and antimicrobial response. In neurons, it has been described it role in synaptic plasticity, learning and memory. The main goal of this work was to investigate the crosstalk between ROS and calcium over NFBB activation in cultured neurons by electrical field stimulation. ROS generation was monitored by the HyperCyto plasmid, which recognizes H2O2, the calcium level was observed with FuraRed loaded as the AM species and for NFBB cell location, eGFP-p65 was used. This work shows that by field electrical stimulation in neurons, there is an increase in both, ROS production and intracellular calcium concentration as well as a p65 translocation to the nucleus from the cytoplasm. It was also observed that ROS increase was not affected by the presence of BAPTA loaded as the AM species or by the absence of extracellular calcium. ROS production was lowered by preincubation with ryanodine at inhibitory concentrations of calcium release. While the calcium concentration increase, was not affected by DPI incubation, which is a ROS generating enzyme inhibitor. Also it was shown that p65 translocation due to field electric stimulation, was prevented by ryanodine incubation, and by N-acetilcysteine (NAC) preincubation, NAC is an antioxidant molecule. These phenomena were also seen in stimulated neurons at lower pulses amplitudes or frequency. Together, these results show that there is crosstalk between calcium and ROS in our experimental model. This crosstalk is also involved in NFBB activation, specifically with depolarizing stimuli on neurons. They also lead to postulate the function of the reticulum through its ryanodine receptor calcium channel as the main calcium source for this process, as well as pointing out that H2O2 is a relevant ROS involved in the mechanism studied in this work.