TGF-ß1 previene el estrés de retículo endoplásmico y la muerte celular inducida por isquemia/reperfusión simulada en fibroblastos cardiacos de rata

Abstract

En el corazón, los fibroblastos son las células más abundantes y tienen características estructurales y funcionales muy determinadas: a) actúan como sensores de los cambios del entorno reaccionando frente a estímulos externos; b) secretan factores de crecimiento, citoquinas, y poseen sus receptores; c) tienen una alta capacidad proliferativa; d) secretan una gran cantidad de proteínas de matriz extracelular; e) se diferencian a un fenotipo conocido como miofibroblasto, los que participan activamente del proceso de cicatrización tisular después de una injuria cardiaca. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas, estas deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (RE) a través de un complejo proceso en el que participan proteínas conocidas como proteínas chaperonas. Cuando por diversos factores como alteración de la homeostasis del calcio, estrés oxidativo, estado redox, isquemia o isquemia/reperfusión, se altera la homeostasis del RE, se afecta el plegamiento y maduración de proteínas en vías a ser secretadas, conduciendo a un estado celular conocido como Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE). Esta nueva condición activa la Respuesta a Proteínas Mal Plegadas, que induce mecanismos compensatorios que llevan al aumento de la expresión de chaperonas del RE. Cuando esta respuesta no es capaz de recuperar la homeostasis del plegamiento de proteínas, se gatilla la expresión del factor transcripcional CHOP que activa la expresión de genes que conducen a la muerte celular de tipo apoptótica. En este estudio se demostró que tanto isquemia como Isquemia/Reperfusión (I/R) simuladas (cultivo de fibroblastos en medio isquémico y cámara hipóxica), son capaces de generar una pérdida significativa en la viabilidad celular de fibroblastos cardíacos neonatos de rata (FCNR). La pérdida de viabilidad celular es debido a que tanto isquemia como I/R son capaces de inducir ERE, evidenciado por un aumento de los niveles de CHOP (8 horas de isquemia y 8 horas de isquemia seguidas de 24 horas de reperfusión), resultando en una pérdida de un 25% y un 50% de la viabilidad celular en isquemia e I/R respectivamente. Muchos han sido los intentos para solucionar el principal problema que se genera ante un evento isquémico, la muerte celular. En la literatura se ha reportado que TGF-β1 es capaz de generar un efecto cardioprotector en cultivos primarios de cardiomiocitos sometidos a isquemia e I/R. Nuestros resultados muestran que TGF-β1 a una concentración de 5 ng/mL, disminuye, aunque no totalmente, la pérdida de viabilidad de FCNR inducida por isquemia e I/R. De igual manera, nuestros resultados muestran que esta citoquina es capaz de bloquear totalmente el aumento en la expresión de CHOP inducidos por isquemia e I/R simuladas. De estos resultados se concluye que tanto en isquemia como I/R, la pérdida de la viabilidad celular se debe, al menos en parte, al ERE, un efecto que es atenuado por TGF-β1, no descartando que existen otros mecanismos no regulados por ERE que generan la pérdida de viabilidad celular. Una segunda alternativa para enfrentar este problema, fue la utilización de la chaperona química Ácido 4-fenilbutírico (4-PBA, quien ha demostrado proteger del ERE por tapsigargina en FCNR). Nuestros resultados muestran que distintas concentraciones de 4-PBA en isquemia, o pre-incubando los FCNR 24 horas antes de realizar la isquemia con 4-PBA, no se observó un efecto sobre la pérdida de viabilidad celular. Si bien estos resultados son discordantes con TGF-β1, fortalece la idea de que el ERE es parte de la perdida de viabilidad celular o que TGF-β1 gatilla vías de sobrevida, una de las cuales podría ser frenar la muerte celular inducida por ERE

In the heart, fibroblasts are the most abundant cell type and they have very specific structural and functional features: a) act as sensors of changes in the environment reacting under external stimuli; b) secrete growth factors, cytokines and have their receptors; c) have a high proliferative capacity; d) secrete a large amount of extracellular matrix proteins; e) differentiate into a phenotype known as myofibroblast, which is involved in the wound healing process after a cardiac injury. In the protein secretion process, once synthesized, they have to be fold inside the endoplasmic reticulum (ER) through a complex process in which are involved many proteins known as chaperone proteins. When because of many factors such alterations in calcium homeostasis, oxidative stress, redox state, ischemia or ischemia/reperfusion (I/R), is altered the endoplasmic reticulum homeostasis, the fold and maturation of proteins in the secretory pathways is affected, leading to a state known as Endoplasmic Reticulum Stress (ERS). This new condition activates de Unfolded Protein Response, which induces compensatory mechanisms that leads to an increase of the expression of the chaperone proteins of the endoplasmic reticulum. When this response is not able to restore homeostasis in the correct protein folding, it triggers the expression of the transcriptional factor CHOP that activates the expression of genes that lead to cell death by apoptosis. In this study we demonstrated that either simulated ischemia or I/R (fibroblast culture in ischemic medium and hypoxic chamber), are capable to generate a significant loss of cardiac fibroblast viability. The loss of cell viability is because either ischemia and I/R are capable of inducing ERS, evidenced by an increased levels of CHOP (8 hours for ischemia and 8 hours of ischemia followed by 24 hours of reperfusion), resulting in a loss of 25% and 50% of cell viability in ischemia and I/R. There have been many attempts to solve the principal problem of an ischemic event, the cell death. In literature has been reported that TGF-β1 is capable of generating a cardio protective effect in primary cardiac myocytes cultures under ischemia and I/R. Our results show that TGF-β1 [5 ng/mL], decreases, although not entirely, the loss of cardiac fibroblasts viability induced by ischemia and I/R. Similarly, our results show that this cytokine is able to block totally the increase in the expression of CHOP induced by ischemia and I/R. From these results it is concluded, that either in ischemia as well as in I/R, the loss of cell viability is due, at least in part, to ERS, and it is attenuated by TGF-β1, not ruling out that there are other mechanisms not regulated by ERS that lead to a loss of cell viability. A second alternative to face this problem, was the use of the chemical chaperone 4-PBA (who has demonstrated protect from cardiac fibroblast death thapsigargin-induced by ERS cardiac fibroblasts). Our results show that different concentrations of 4-PBA in ischemia, or pretreatment the cardiac fibroblasts by 24 hours before the ischemia with 4-PBA, don´t have any effect in the loss of cell viability. Although these results are discordant with TGF-β1, they strengthen the idea that the ERS is a part of the loss of cell viability, or that TGF-β1 triggers survival pathways, one of which could be to prevent ERS cell death