Expresión y localización de proteínas de uniones estrechas (tight junctions) de células acinares de glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren

Abstract

El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad inflamatoria, autoinmune, crónica de etiología desconocida, que compromete esencialmente a las glándulas salivales y lagrimales, generando xeroftalmia (sequedad ocular) y xerostomía (sequedad bucal). Las glándulas salivales de los pacientes con este síndrome presentan cambios importantes en la estructura, organización y funcionalidad del parénquima glandular y de la matriz extracelular. En células acinares, pérdida de polaridad celular, pérdida de microvellosidades apicales, dilatación de lúmenes, redistribución de aquaporina 5 y presencia de colágenos de la matriz extracelular en el lumen de los acinos, son indicadores que la organización del polo apical y la polaridad de estas células está alterada. Un estudio mediante microarreglos de cDNA reveló que las glándulas salivales de pacientes SS presentan una sobreexpresión del mRNA de claudina-4, mientras que los niveles de mRNA de ocludina (ocln), ZO-1, claudinas (cldn)-1, -3, -5, -10, -18 y -23 fueron similares a los controles. En los epitelios en general, y en los acinos en particular, una de las estructuras que participan en la regulación de la organización del polo apical y mantención de la polaridad celular son las Uniones Estrechas (UE) o tight junctions. Estos complejos de unión localizados en la porción más apical de las células epiteliales participan en la difusión de iones, a través de la vía paracelular. Sus funciones más relevantes son: 1) formar la primera barrera que evita el transporte paracelular de solutos y 2) restringir la difusión lateral de proteínas de membrana plasmática, y así mantiene la asimetría entre dominio apical y basolateral. En esta memoria, se abordó el estudio de algunas proteínas de membrana plasmática que son componentes de la Unión Estrecha, claudina-1 -3, -4, ocludina y una proteína citoplasmática, ZO-1. Estos antecedentes y otros, permiten postular la siguiente hipótesis de trabajo: “La pérdida de polaridad de células acinares de glándulas salivales de pacientes con síndrome de Sjögren, y la desorganización de su polo apical, están asociadas a los cambios en expresión génica y de niveles de proteínas de las Uniones Estrechas. Estos cambios en expresión están acompañados de una localización alterada de las proteínas constituyentes de la UE”. Para evaluar esta hipótesis, se determinaron los niveles de mRNA de claudina-4 y de proteínas de claudina-1, -3, -4, ocludina y ZO-1 en glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes con síndrome de Sjögren y se compararon con los resultados obtenidos en individuos controles. Además, mediante inmunohistoquímica/inmunofluorescencia, se analizó la localización de claudina-3, -4, ocludina y ZO-1. Los niveles relativos de mRNA para claudina-4 no mostraron diferencias significativas entre pacientes y controles (p=0,052). Los niveles relativos de proteínas de claudina-3, ocludina sin fosforilar y ocludina total, no mostraron diferencias significativas entre el grupo total de pacientes y el grupo control (p=0,052, p=0,06 y p=0,089, respectivamente), sin embargo, al separar el grupo de pacientes de ocludina total en dos subgrupos, de acuerdo a su nivel de expresión, se encontró que sólo el grupo con niveles bajos de ocludina total mostraron diferencias significativas respecto al grupo control (p=0,0008). Los niveles de proteína de claudina-1 y -4 fueron significativamente mayores en pacientes SS, respecto a controles (p=0,023 y p=0,04, respectivamente). Sin embargo, los niveles proteicos relativos de ocludina fosforilada y ZO-1, fueron significativamente menores en pacientes SS que en controles (p=0,034 y p=0,033, respectivamente). En pacientes SS, la localización subcelular de las proteínas que forman las UE, mostraron una marca intensa para claudina-3 y -4, en la superficie apical de acinos y ductos de GSL, y a diferencia de los controles, también se observó marca en la superficie basolateral de acinos. Mientras que ocludina y ZO-1 mostró una disminución marcada, sin modificar su localización en el polo apical de las células acinares y ductales. Estos resultados apoyan la hipótesis, que acinos provenientes de GSL de pacientes SS presentan cambios en los niveles de algunas proteínas de UE y en su localización, los cuales explicarían las alteraciones en las UE. Más aún, estos resultados podrían explicar, en parte, la pérdida de organización detectada en el polo apical de los acinos, y podrían correlacionarse con la hipofuncionalidad secretora observada en pacientes SS

Sjögren`s syndrome (SS) is a chronic autoimmune, inflammatory disease of unknown etiology that essentially compromises lachrymal and salivary glands, producing xeroftalmia (ocular dryness) and xerostomía (oral dryness). The salivary glands of SS patients present important changes in the structure, organization and functionality of the glandular parenchyma and extracellular matrix. In acinar cells, the loss of cell polarity, loss of apical microvilli, luminal dilatation, redistribution of aquaporin 5 and presence of collagens from extracellular matrix in acinar lumen, are indicators of alterations in the apical pole. A cDNA microarray analysis revealed that the salivary glands from SS patients present an overexpression of claudin-4, while the levels of gene expression of occludin, ZO-1, claudin -1, -3, -5, -10, -18 and -23 were similar to the levels found in samples from control individuals. In epithelia and acini in particularly, one of the structures that participate in the regulation of the organization of the apical pole and maintenance of cell polarity are the tight junctions (TJ). These union complexes are located in the apical zone of the epithelial cells participating in the diffusion of ions through the paracellular space. TJ most prominent functions are: 1) to form the first barrier that avoids the paracellular transportation of solutes and 2) to restrict the lateral diffusion of plasma membrane proteins, and thus maintain the asymmetry between the apical and basolateral compartments. In this thesis, the study of TJ components such as the plasma membrane proteins, claudin-1 -3, -4, occludin, and a cytoplasmic protein, ZO-1 was undertaken. We thus postulated the following working hypothesis: "The loss of cell polarity in salivary glands of SS patients and the disorganization of their apical pole, are associated with changes in gene expression and protein levels of TJ. These changes in expression are associated with localization changes of proteins that are part the TJ". To evaluate this hypothesis, the mRNA levels of claudin-4 and protein levels of claudin-1, -3, -4, occludin and ZO-1 in GSL were determined in salivary glands from SS patients and compared with those of control individuals. Using immunohistochemistry/immunofluorescene, the localization of claudin-3, -4, occludin and ZO-1 was also analyzed. The relative mRNA levels of claudin-4 did not show significant differences between patients and controls (p=0.052). The relative protein levels of claudin-3, non phosphorylated occludin and total occludin, did not show significant differences between patients and the control group (p=0.052, p=0.06 and p=0.089, respectively), nevertheless, when the patients group were divided in two sub-groups, according to their level of expression of total occludin, only the group with low levels of total occludin showed differences with the control group (p=0.0008). The protein levels of claudin 1, and-4 were significantly higher in SS patients with respect to controls (p=0.023 and p=0.04, respectively). However, the relative protein levels of phosphorylated occludin and ZO-1, were significantly lower in SS patients compared to controls (p=0.034 and p=0.033, respectively). In SS patients, the subcellular localization of the TJ proteins, showed an intense signal for claudin-3 and -4, in the apical surface of acini and ducts, and in contrast to the control group, it was also detected in the basolateral surface of acini. On the other hand, ocludin and ZO-1 showed a decreased signal and maintaining their localization in the apical pole of acinar and ductal cells. These results support the hypothesis, that acini from LSG of SS patients present changes in some TJ proteins levels and in their localization correlating with alterations in TJ. Moreover, the latter could explain in part, the loss of organization detected in the acini apical pole, which would correlate with the secretory hypofunctionality observed in SS patients