Caracterización de microdominios lipídicos en membranas apicales de sinciciotrofoblasto placentario humano

Abstract

Los “lipid rafts” son pequeños dominios de membrana, heterogéneos y dinámicos, constituidos por elevados niveles de colesterol y glicoesfingolípidos. Se encuentran directamente involucrados en la estructuración y organización celular. Son, por lo tanto importantes en la mantención de la funcionalidad de los diversos tejidos, los órganos y sistemas, a nivel macromolecular. El sincinciotrofoblasto (STP) es el epitelio que constituye la principal barrera al transporte materno-fetal en la placenta de término. Con anterioridad, se ha descrito la presencia de dos fracciones dentro de la membrana apical del STP. Una fracción pesada (MVM) y otra más liviana (L-MVM), obtenidas mediante centrifugación diferencial y separación en gradiente de sacarosa. Sin embargo, a pesar de importantes evidencias, no se ha establecido formalmente la presencia de microdominios lipídicos en el dominio apical del STP. El propósito de esta memoria fue obtener y caracterizar la presencia de rafts en ambas fracciones de membrana apical de STP. Para esto, se determinó el contenido de colesterol a L-MVM y MVM y luego se implementó una metodología de extracción de membranas resistentes a detergente (DRMs), utilizando 1% Tritón X-100, y gradiente de sacarosa. Luego de la centrifugación, se recolectaron las muestras y se analizaron por “immunoblotting” para marcadores específicos de rafts (Fosfatasa alcalina placentaria, Anexina A2 y Gangliósido GM1) y de no-raft (Receptor humano de Transferrina). Los resultados obtenidos mostraron que L-MVM y MVM tienen diferencias significativas en la cantidad de colesterol. Además, desde ambas fracciones se obtuvieron DRMs, en los cuales los marcadores detectados, mostraron diferente intensidad de señal y distribución. En conclusión, cada fracción apical contiene “rafts”, pero de distinta composición. Este hallazgo podría ser el origen de la separación de las fracciones y en conjunto constituye la primera evidencia de la presencia de microdominios en el STP, siendo un aporte al entendimiento del modelo de transporte materno-fetal.

Lipid rafts are small membrane domains, dynamics and heterogeneous, constituted by high cholesterol levels and glycosphingolipids. Rafts are directly involved in the structuring and cellular organization. Therefore, at a macromolecular level, they are important in the functionality of diverse tissues, organs, and systems. Syncytiotrophoblast (STP) is an epithelium that constitutes the main barrier to maternal-fetal transport in the term placenta. Previosly, it has been described the presence of two fractions within the apical membrane of STP. A heavy (MVM) and a light fraction (L-MVM), obtained by differential centrifugation and sucrose gradient separation. Nevertheless, in spite of important evidences, the presence of lipid microdomains in the apical domain of STP has not been verified formally. The aim of this thesis was to obtain an characterize the presence of lipid rafts in both apical membranes fractions of STP. For this purpose, the cholesterol content was determined to L-MVM and MVM, and a methodology was implemented for the obtention of detergent resistant membranes (DRMs), using 1% Triton X-100, and sucrose gradient flotation. After ultracentrifugation, the samples were collected and analysed by immunoblotting for specific raft-markers (Placental alkaline phosphatase, Annexin A2 and Ganglioside GM1) and non raft marker (Human Transferrin receptor). The results obtained showed that L-MVM and MVM have significant differences in the amount of cholesterol. In addition, DRMs were obtained from both fractions, in which the detected markers showed different signal intensity and distribution. In conclusion, each apical fraction contains lipid rafts, but their composition is different . This finding could be the cause of the separation of the fractions together, it constitudes the first evidence for the presence of rafts in the STP, making a contribution to the understanding of the maternal-fetal transport model.