Evaluación de la estabilidad de Pravastatina

Abstract

En esta Memoria se desarrolló una metodología por HPLC, para ser empleada en el estudio de estabilidad hidrolítica del fármaco hipocolesterolémico pravastatina. Las condiciones óptimas fueron alcanzadas luego de llevar a cabo el ensayo de aptitud del sistema (system suitability test, USP XXVII), y consistieron en una fase móvil isocrática: acetonitrilo/tampón fosfato 30 mM, pH 2.0 (28/72), flujo 1 mL/min a 40 ºC. Las condiciones óptimas se seleccionaron en base a la combinación adecuada entre los valores de resolución (R), factor de capacidad (k’), selectividad (α),tiempos de retención de cada señal y el tiempo de corrida del cromatograma. En estas condiciones pravastatina exhibió un tiempo de retención (tr) promedio de 8.95 min (n=10), R= 2.1, k’= 5.5 y =1.16. La metodología exhibió características analíticas de repetibilidad (CV=0.11 %) y reproducibilidad (CV=0.49 %) adecuadas para ser empleada en estudios de estabilidad. Para la cuantificación se empleó el método de la curva de calibración, que estuvo descrita por la ecuación: ABC = 2.74×1010 [c] + 72267 (r= 0.99992; n= 7). Los límites de detección y cuantificación calculados fueron 3.4×10-7 M y 3.7×10-6 M, respectivamente. El estudio de estabilidad se realizó a cuatro concentraciones iniciales, tres temperaturas y cinco pH en tampón fosfato 30 mM, con el fin de lograr interpretar la influencia de estas variables sobre la velocidad de degradación de pravastatina. En todas las condiciones de pH y temperatura ensayadas se obtuvo una cinética mixta, en las cuales se ajustó a una cinética de seudo primer orden hasta aproximadamente el 50 % de degradación del fármaco. Para evaluar la influencia del pH en la degradación, se ensayaron los pH 3, 5, 7, 9 y 12. A pH < 7 los cromatogramas presentan cinco nuevas señales correspondientes a los productos de degradación, a tr de 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min y 19.47 min. A pH > 7 sólo se observa la aparición de una nueva señal, a tr de 1.90 min. En todos los casos estudiados, las nuevas señales presentan un espectro UV análogo al de pravastatina, lo cual indica que la hidrólisis no afecta la estructura cromófora del fármaco. Con el objeto de evaluar la influencia de la temperatura sobre la degradación de pravastatina, se llevaron a cabo experimentos a 40, 60 y 80 ºC, obteniéndose que la constante de velocidad de degradación (k) aumenta en forma concomitante con el incremento de la temperatura. Además se reportan los valores de energías de activación, vidas medias y t90 calculadas para la degradación de pravastatina. Adicionalmente se estudió la reactividad de pravastatina frente a radicales libres y peroxinitrito, como modelos predictivos de su estabilidad oxidativa tanto en preformulaciones como in vivo. Se empleó como técnica analítica la espectrofotometría UV-Visible y como generadores de radicales alquilo ABAP+ N2, radicales alquilperoxilo ABAP + O2, y ABTS (radicales ABTS+). Para evaluar la reactividad frente a peroxinitrito se empleó SIN-1. La reactividad frente a ABAP y SIN-1 se llevó a cabo siguiendo la señal del fármaco a 240 nm, empleando el método de la curva de calibración (A = 2.04×10-8 [c] + 4.55×10-9). Para ABTS+ se siguió el decaimiento de su señal a 734 nm. Pravastatina (40 M a 100 M) fue reactiva frente a todos los compuestos ensayados, encontrándose que el orden de reactividad fue: peroxilo (k=1.13×10-2 min-1)  alquilo (k=7.07×10-3 min-1) > peroxinitrito (k=2.68×10-3 min-1)  ABTS.+ (k=1.20×10-3 min-1). Además, se informa la reactividad de estos compuestos frente otros análogos estructurales de la pravastatina: los profármacos lovastatina y simvastatina, y sus análogos de cadena abierta obtenidos experimentalmente por hidrólisis alcalina exhaustiva.

In this Thesis a methodology by high HPLC was developed, with aim to be used in the stability study in front of hydrolysis of the hypocholesterolemic drug pravastatin. The optimal conditions were reached after carried out the system suitability test according to USP XXVII, which consisted of an isocratic mobile phase of 30 mM acetonitrile/phosphate buffer, pH 2.0 (28/72), flow rate of 1 mL/min at 40 ºC. The optimal conditions were selected on the basis of the combination between the values of resolution (R), capacity factor (k'), selectivity (α), the retention times of each signal and the run time of the chromatogram. In these conditions pravastatin exhibited a retention time (Rt) average of 8.955 min (n =10), R = 2.1, k' = 5.5 and α = 1.16. The methodology exhibited analytical characteristics of repeatability (CV=0.11 %) and reproducibility (CV=0.49%) adequate to be used in stability studies. For the quantification the calibration curve method was used, and was described by the equation: ABC=2.74×1010 [c] + 72267 (r =0.99992; n=7). The detection and quantification limits were 3.4×10-7 M and 3.7×10-6 M, respectively. The stability study were carried out at four initial concentrations, three temperatures and five pH in 30 mM phosphate buffer, with the aim of evaluate the influence of these variables on the pravastatin degradation. In all the tested conditions of pH and temperature a mixed kinetic was obtained, in which it adjusted to a pseudo-first order kinetic until approximately 50% of degradation of the drug. In order to evaluate the effect of pH on the degradation, pH 3, 5, 7, 9 and 12 were assayed. At pH<7, five new signals corresponding to degradation products appears in the chromatograms, with Rt of 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min and 19.47 min. At pH>7 only a new signal in the chromatograms was observed, at the same Rt of 1.90 min. In all the studied cases, the new signals display an UV spectrum similar to that of pravastatin, which indicates that the hydrolysis process does not affect the chromophore structure of the drug. With the aim to evaluate the influence of temperature on the hydrolytic degradation; experiments at 40, 60 and 80 ºC were carried out. From these experiments was obtained that the degradation rate constant (k) increases concomitantly as the temperature increase. Also, activation energies values, half lives and t90 values for the degradation of pravastatin are reported. Additionally, the reactivity of pravastatin in front of free radicals and peroxinitrite, as predictive models of its oxidative stability in both preformulations and in vivo, were studied. For this study UV/Vis spectrophotometry was used as analytical technique and ABAP + N2 as alkyl radical’s generator, ABAP + O2 as alkylperoxyl radical’s generator, and ABTS (ABTS+). The reactivity with peroxynitrite was evaluated by using SIN-1. The reactivity of pravastatin in front of ABAP and SIN-1 was assess following the spectrophotometric signal of the drug at 240nm, using the calibration curve method (A = 2.04×10-8[c] + 4.55×10-9). For ABTS+ the decay of its signal at 734 nm was used. Concentrations of pravastatin in the range of 40 μM to 100 μM were studied. The drug was reactive in front to all the compounds assayed, and the reactivity ranking was: ABAP+O2 (k=1.13×10-2 min-1) ≥ ABAP+ N2 (k=7.07×10-3 min-1) > SIN-1 (k=2.68×10-3 min-1) ≥ ABTS (k=1.2×10-3 min-1), that means: alkylperoxyl ≥ alky > peroxynitrite ≥ ABTS•+. In addition, the reactivity of these compounds in front other structural analogous of pravastatin: the prodrugs lovastatin and simvastatin, and their analogous of open chain experimentally obtained by exhaustive alkaline hydrolysis are reported.