Estudio del efecto antineoplásico de nitrosos aril dihidropiridinas

Abstract

Los Análisis electroquímicos de nitrosos aril dihidropiridinas muestran que estos compuestos pueden modificar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS). Los ROS son pro-oxidantes derivados del oxígeno que en concentraciones fisiológicas pueden estar involucrados en transducción de señales, que durante un estrés oxidativo se encuentran en exceso y pueden provocar daños a importantes funciones biológicas afectando la viabilidad celular. De hecho, el incremento en la producción de ROS ha sido implicado en muchos procesos fisiológicos y patológicos incluyendo envejecimiento y carcinogénesis. Dada la importancia de estas especies, tanto en procesos normales como patológicos, se estudió el potencial efecto antitumoral de estos nitrosocompuestos. Para ello, se evaluó el efecto de los nitrosoderivados sobre la viabilidad celular utilizando las líneas de células tumorales (RAW, U937, K562) y células mononucleares obtenidas desde sangre periféricas de donantes normales (PBMC), mediante ensayos con el reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolium (MTS). También se cuantificó el efecto sobre la generación de ROS en células tumorales y PBMC usando el marcador diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA). Además, debido a la importancia de la enzima COX-2 en el desarrollo de la tumorogénesis, se evaluó el efecto de los nitrosocompuestos sobre la actividad de esta enzima inducida in vitro por LPS. Finalmente, se midió el efecto sobre la actividad citotóxica de las células Natural Killer mediante el ensayo de liberación de 51Cr desde células blancos radiomarcadas, dado que las células NK representan una importante defensa del sistema inmune innato contra células tumorales. Nuestros resultados indicaron que los nitrosos aril dihidropiridinas generan un efecto citotóxico dosis dependiente sobre las células tumorales. Sorprendentemente las células PBMC muestran mayor resistencia al efecto de estos nitrosoderivados, lo cual, se refleja en los IC50 obtenidos de los análisis de viabilidad celular, donde los IC50 para células tumorales variaron entre 4-19 μM, en cambio, para células PBMC variaron entre 43-63 μM. Por otro lado, los resultados obtenidos de los experimentos de generación de ROS mostraron que los nitrosocompuestos aumentan los niveles de ROS en células K562, pero no en PBMC. También, se observó una inhibición de la expresión de COX-2 inducida por Lipopolisacárido (LPS) por efecto de los nitrosocompuestos. Además, la actividad de las células NK no varió por acción de estos compuestos en ninguna de las concentraciones analizadas. Estos resultados sugieren que los nitrosocompuestos presentan citotoxicidad principalmente sobre células tumorales la que podría estar mediada por generación de ROS. La inhibición de la expresión de COX-2 potenciaría esta actividad antitumoral. Además, al no afectar la actividad de las células NK mantienen activa la respuesta antitumoral inmunológica innata. Los resultados obtenidos permiten concluir que los nitrosocompuestos presentaron una importante actividad antineoplásica sin afectar de manera significativa la viabilidad de las células mononucleares ni la Actividad citotóxica de células Natural Killer (ACNK). Esto, asociado al efecto sobre COX-2, refuerza el potencial antitumoral de estos compuestos lo cual apoya estudios adicionales para dilucidar su mecanismo de acción

Electrochemical analisys of dihidropyridines show that these compounds can modify intracellular levels of reactive oxygen species (ROS). ROS are pro-oxidating derivatives of oxygen, which at physiological concentrations can be involved in signals transduction. However, during oxidative stress, high levels of ROS have additional unfavorable effects upon crucial biological function which can dramatically affect cellular viability. In fact, increase in the production of ROS has been implicated in many human disease processes, including aging and carcinogenesis. Thus, due to the importance of nitrosocompounds, both in normal and pathological processes, we decided to study the potential antitumoural effects of these derivatives. For this reason we studied the in vitro effects of nitroso aril dihidropyridines on the cellular viability of several tumour cells lines (RAW, U937, K562) and also in PBMC using the reagent 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. Besides, the intracellular generation of ROS in the presence of nitrosocompounds in tumor cells and PBMC was measured with the fluoroprobe CM-H2 DCFDA (5-(and -6)-chloromethyl-2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate). Because COX-2 plays an important role in carcinogenesis and its expression is modulated by ROS we evaluated the effect of Nitrosocompounds on the in vitro Lipopolisacarid (LPS)-induced expression of COX-2. An important defense of the innate immune response against tumor cells is due to NK cell function. Thus, we measured the effect of Nitrosocompounds on the natural killer citotoxic activity of PBMC using the Cr51 release assay. Our findings indicate that the dihidropyridines derivatives produce a dose response citotoxic effect on tumour cells. Surprinsingly, PBMC showed to be more resistance to the effect of these nitrosoderivates. In fact the IC50 values for tumour cells viability varies between 4-19 μM while for PBMC the IC50 values ranged between 43-63 μM. This result correlates with ROS generation were nitrosocopounds significantly raised ROS levels in K562 cells, but not in PBMC. Moreover, nitrocompounds induced an important inhibition of LPS induced-COX-2 expression in RAW cells. On the other side, NK cell activity of PBMC was not modified by these composed. These findings suggest that the nitrosoderivatives exerted a citotoxic effect mainly on the tumour cell lines studied and that correlates with and increased ROS levels and an inhibition of COX-2 expresion. In conclusion these results indicates that nitrosoderivatives have a potential antitumour activity