Desarrollo de metodologías analíticas para la cuantificación y caracterización de 2-(o-nitrofenil)-benzimidazol y N-benzoil-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol

Abstract

En esta Memoria se presenta el desarrollo y la puesta punto de metodologías analíticas reproducibles y selectivas, y su posterior aplicación en estudios de degradación de 2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (NB) y N-benzoil-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (BNB). Dichos estudios se llevaron a cabo usando las técnicas de polarografía de pulso diferencial (PPD), polarografía tast (PTAST), voltametría cíclica (VC), espectrofotometría UV-Vis, cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) y además estudios computacionales de modelamiento molecular. En una primera etapa se llevó a cabo el estudio de influencia del pH por PPD y PTAST. En amplio rango de pH para ambos compuestos, estos exhiben dos señales de reducción: una señal principal debida a la reducción del grupo nitro y una secundaria, probablemente correspondiente al enlace azometino presente en el anillo benzimidazólico. Ambas señales son dependientes de pH, desplazándose hacia potenciales más negativos mientras más alcalino es el pH. En una segunda etapa se desarrollaron tres metodologías analíticas para la cuantificación de los compuestos en estudio (PPD, HPLC y espectrofotometría UV-Vis), las cuales exhibieron valores adecuados de reproducibilidad (CV< 4.5%) y repetibilidad (CV< 4%), presentando linealidad en un amplio rango de concentración (1.0×10-6 M a 1.0×10-4 M) para ambos compuestos. Además, por medio de la técnica de PPD se llevó a cabo el estudio de la cinética de degradación hidrolítica de BNB, a distintos valores de pH y temperaturas, encontrándose una cinética de pseudo orden uno en las condiciones ensayadas. Por otra parte, a pH 5.0 el compuesto presenta su máxima estabilidad, con t1/2= 39 horas. Por último, se determinó la energía de activación para este compuesto, presentando un valor de 14.90 Kcal/mol a pH 7.4. Mediante VC se completó la caracterización redox para NB, estudiando la influencia del pH y de la velocidad de barrido. Los voltamperogramas de NB en medio acuoso muestran señales irreversibles, presentando dos señales de reducción al igual que en PPD. Por espectrofometría UV-Vis se determinaron las constantes de ácidez para cada compuesto, los grupos responsables de dichas constantes son los nitrógenos ubicados en el anillo imidazólico en ambos casos, para estos grupos se obtuvieron valores de pKa de 5.69 (-N=C-) y 11.38 (-NH) para NB y de 4.90 (-N=C-) para BNB. Empleando HPLC se determinaron los coeficientes de partición respectivos, presentando valores de log P de 2.2 para NB y de 3.1 para BNB. Estos valores son coherentes con el elevado carácter apolar de los compuestos en estudio. Siguiendo con la caracterización de NB y BNB, se realizó la determinación de la constante de permeabilidad efectiva [Pe], mediante el ensayo PAMPA, utilizando espectrofometría UV-Vis y HPLC para su cuantificación, encontrándose valores de 0.8 x 10-5 cm/seg y 1.2 x 10-5 cm/seg, respectivamente. Finalmente se realizó un estudio computacional de modelamiento molecular, para poder así dilucidar la conformación espacial de mínima energía de los compuestos en estudio. Para ello se realizó una búsqueda conformacional para encontrar los mínimos globales siguiendo un protocolo de templado simulado iterativo (TSI). Para evaluar si las estructuras obtenidas son estables en un entorno similar al del agua y en función del tiempo se realizó una simulación de dinámica molecular. Para evaluar si existen puentes de hidrógeno intramoleculares, se estudió la distancia entre el protón (-NH) y el grupo nitro (NO2) encontrándose valores de 3 Å a 4.5 Å, lo cual implica que no hay formación de puente de hidrogeno intramolecular entre estos dos grupos. En el caso de BNB se evaluó el grado de interplanaridad existente entre los anillos benzimidazol y los sustituyentes, encontrándose que no existe coplanaridad de los mismos.

In this Thesis the development and application of reproducible and selective analytical methodologies, to characterize 2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (NB) and N-benzoil-2-(o-nitrofenil)-benzimidazol (BNB) were carried out. To get these purposes, differential pulse polarography (DPP), tast polarography (PTAST), cyclical voltammetry (CV), UV-Vis spectrophotometric and high performance liquid chromatography (HPLC) were employed. In the characterization of NB and BNB molecular modelling computational studies were included. In the first step, a study of pH influence by DPP and PTAST was carried out. In wide range pH studied, both compounds exhibited two reduction signals, a main signal due to the reduction of the nitro group and secondary one, probably corresponding to the azometine moiety present in the benzimidazole ring. Both signals were pH dependent, shifting cathodically with the pH increases. In the second step analytical methodologies for the quantification of the compounds (DPP, UV-vis spectrophotometry and HPLC) were developed, they exhibited suitable values of reproducibility (CV<4.5%) and repeatability (CV<4%). In addition, linearity in a wide range of concentration (1.0×10-6 M to 1.0×10-4 M) for both compounds was obtained. Furthermore by DPP the study of the hydrolytic degradation of BNB was carried out, at different pH and temperatures, finding a pseudo first order kinetic in the experimental conditions assayed. In addition, BNB present the highest stability at pH 5.0, with t1/2 = 39 hours. Furthermore, the calculated activation energy for this compound was 14.90 Kcal/mol at pH 7.4. By means of CV the redox characterization for NB was accomplished changing pH and scan rate. NB voltammograms in aqueous medium showed irreversible signals as had been previously observed by DPP. By UV-Vis spectrophotometry the dissociation constants for both compounds were determined. pKa values of 5.69 (N=C-) and 11.38 (NH) for NB and of 4.90 (N=C-) for BNB were obtained. Values of coefficients of partition of 2.2 for NB and 3.1 for BNB were obtained using HPLC. These values were according with chemical structures of both compounds. The constant of effective permeability [ Pe ] were determinate by using PAMPA test and UV-Vis spectrophotometry and HPLC, obtaining values of 0.8 x 10-5 cm/s and 1.2 x 10-5 cm/s for NB and BNB, respectively. Finally, a molecular modeling study was carried out to find the low energy conformations that adopt the compounds. A conformational search following an Iterative simulated protocol (TSI) was performed. The global minima of both conformers were found. To determine if these structures are stable within the time and in an aqueous environment, molecular dynamic simulations were carried out. In order to determine if intramolecular hydrogen bonds are present, the distance between the proton (-NH) and the nitro group (NO2) was 3 Å - 4.5 Å for the NB conformers, which indicate that intrameolecular hydrogen bond between these two groups is not present. In the case of BNB the degree of interplanarity between the rings benzimidazole and benzoile molecule was evaluated, observing that they are not coplanar.