Microflora en ostras chilenas y su incidencia en la colonización por vibrios patógenos y en la descomposición post cosecha

Abstract

La depuración es un proceso empleado para reducir el numero de bacterias peligrosas en los bivalvos se consumen crudos y enteros, con toda su carga bacteriana, que en algunos casos puede incluir vibrios patógenos. La carga bacteriana consiste de bacterias autóctonas y alóctonas. Las bacterias autóctonas constituyen la microflora normal, que puede tener importantes interacciones con la ostra. Un mayor conocimiento de la ecología de la microflora bacteriana en ostras contribuiría al entendimiento del rol de la microflora en la digestión, metabolismo y protección contra patógenos. Este conocimiento podría ser aplicado para mejorar la productividad y calidad sanitaria de las ostras. En este trabajo se describen los conocimientos adquiridos en el estudio de la microflora de la ostra chilena (Tiostrea chilensis). Las poblaciones bacterianas más abundantes en la ostra fueron descritas a través de las técnicas moleculares. Los componentes de la fracción cultivable también se describen, aunque estos representaron una pequeña proporción del total. Se estudiaron dos fenómenos importantes que se relacionan con la microflora bacteriana en ostras: la depuración y la descomposición. Por otra parte, se describe la existencia de polimorfismo en el 16S rDNA en cepas del género Vibrio, dado que en una misma bacteria puede existir más de una secuencia de 16S rDNA, lo que aumentaría aparentemente la diversidad en la muestra analizada. Este estudio permitió definir que la comunidad bacteriana que constituye la microflora total en la ostra alcanza niveles de 1010 bacterias/g por microscopía de epifluorescencia. Sin embargo, la fracción cultivable representó menos del 0,1% del total de las bacterias observadas por microscopía. Dentro de la fracción cultivable las poblaciones más abundantes correspondieron a los géneros Pseudoalteromonas y Vibrio. La composición de la comunidad bacteriana, independientemente de su capacidad para crecer en medios de cultivo, fue ensayada por dos métodos comúnmente usados para la caracterización genética de comunidades bacterianas. Uno fue el análisis de las secuencias nucleotídicas del 16S rDNA y el otro fue el estudio del tamaño de la región intergénica entre los genes 16S y 23S rDNA, también llamada espaciador ribosomal. Este último método es menos informativo, pero es más fácil de realizar. El patrón de los espaciadores bacterianos en una comunidad es obtenido por amplificación por PCR del DNA extraído directamente de la muestra y posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En la mayoría de las ostras, los patrones de espaciadores presentaban un producto importante de aproximadamente 1.000 pb, sugiriendo que una especie bacteriana con ese espaciador, era un componente dominante en la microflora de las ostras. El 16S rDNA contiguo a este espaciador fue posteriormente secuenciado y analizado por BlastN, resultando que este espaciador correspondía a bacterias del género Staphylococcus. El análisis de RFLP del producto de amplificación de los 16S rDNA obtenidos desde ostras, mostró la existencia de un patrón prevalente, indicando que una especie particular era relativamente abundante en ostras. El clonamiento y secuenciación del 16S rDNA con este patrón permitió determinar que este 16S rDNA correspondía a bacterias del género Arcobacter. La discrepancia encontrada entre ambos métodos, se atribuyó a la baja eficiencia de amplificación del espaciador ribosomal en las especies relacionadas con Arcobacter, como consecuencia del pobre alineamiento del primer reverso empleado en esas reacciones. Por lo tanto, bacterias relacionadas con Arcobacter pueden ser un componente común de la microflora de la ostra. La depuración es un proceso empleado para reducir el número de bacterias peligrosas en los bivalvos. Para aprender más acerca del efecto de la depuración sobre la carga bacteriana, se midieron y caracterizaron las bacterias liberadas desde la ostra durante este proceso. La depuración liberó el 30% del total de UFC presentes en ostras, pero sólo un 0,5% de las bacterias totales observadas por microscopía de epifluorescencia. La comparación entre las bacterias liberadas y aquellas que permanecen en la ostra, a través de su patrón de espaciadores 16S-23S rDNA mostró que ambos grupos eran muy diferentes. Estos resultados indicaron que después de la depuración, la mayoría de las bacterias permanecen en las ostras y que la pequeña fracción liberada corresponde a un selecto grupo de cepas dentro de una comunidad más compleja. Las ostras al igual que otros productos del mar, son muy susceptibles a la descomposición. Para identificar las bacterias relacionadas con la descomposición de las ostras, se siguieron los cambios en la carga y en la composición que ocurren durante el almacenamiento. El análisis molecular de la comunidad, reveló que una población particular registró un notable aumento. Estas bacterias portaban un espaciador 16S-23S rDNA de 400 pb y se demostró que ellas correspondían a cepas marinas que requerían sales para crecer y cuya secuencia de 16S rDNA los asociaba a Pseudoalteromonas spp. Por otra parte, el análisis de los 16S rDNAs amplificados desde una única colonia de cepas Vibrios de colección, reveló la existencia de heterogeneidad intragenómica (polimorfismo) cercana al 2% en todas las cepas tipo analizadas. Este polimosfismo fue detectado por la visualización de heterodupletes producidos despúes de la amplificación por PCR de los 16S rDNA de las cepas analizadas, una metodología que permitió examinar una gran cantidad de aislados.El polimorfismo resultó una propiedad común en cepas del género Vibrio, dado que en todas y cada una de este género, que fueron aisladas desde ostras, se observaron 16S rDNA polimórficos. Los sitios polimórficos se concentraron en una región del 16S reconocida como variable.