Purificación, caracterización bioquímica y evaluación de la citotoxicidad del peptido antimicrobiano gicina A

Abstract

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos de síntesis ribosomal producidos por microorganismos, principalmente del dominio bacteria. Las bacteriocinas producidas por bacterias Gram positivo o Gram negativo, presentan una actividad tóxica sobre especies bacterianas estrechamente relacionadas con la bacteria productora. Para ejercer su acción antimicrobiana las bacteriocinas utilizan receptores específicos localizados exclusivamente en la bacteria blanco, por lo tanto raramente se observa actividad citotóxica sobre células eucariontes. No obstante, algunas bacteriocinas inhiben específicamente el crecimiento de líneas celulares neoplásicas. Debido a estas propiedades, las bacteriocinas tienen una potencial aplicación biotecnológica por su posible uso como alternativa a los tratamientos con antibióticos tradicionales, o como nuevos antibióticos contra patógenos multirresistentes, como preservantes o desinfectantes en la industria alimenticia, y en el área biomédica como antineoplásicos para combatir algunos tipos de cáncer. En nuestro laboratorio encontramos un nuevo compuesto antimicrobiano del tipo bacteriocina producido por la cepa de Pseudomonas aeruginosa O400, al que hemos denominado gicina A. Este compuesto es capaz de inhibir, selectivamente, el crecimiento de bacterias Gram positivo. Debido a que no existen informes en la literatura de bacteriocinas producidas por bacterias Gram negativo que presenten actividad antimicrobiana solamente sobre bacterias Gram positivo, el estudio del mecanismo de acción y las propiedades bioquímicas de gicina A constituye un valioso aporte en la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas. El objetivo general de esta tesis fue “Purificar, caracterizar bioquímicamente, y evaluar tanto el mecanismo de acción antibacteriano de gicina A, como su toxicidad in vitro sobre líneas celulares eucariontes”. Para lograr este objetivo se realizó la purificación de gicina A mediante cromatografías en columnas hidrofóbicas y HPLC. Mediante electroforesis de proteínas y espectrometría de masas se determinó que esta proteína tiene una masa molecular de 7925 Da. La evaluación de sus propiedades bioquímicas demostró que la actividad de gicina A es estable a un amplio rango de temperaturas, conserva su actividad al ser solubilizada en una amplia gama de solventes y presenta una mayor actividad al ser solubilizada a un pH neutro. Por otra parte empleado gicina A purificada se confirmó que esta posee una actividad antibacteriana selectiva por bacterias Gram positivo. Estudios de alteración de la cinética de crecimiento de la bacteria blanco y ensayos de microscopía de fluorescencia indicaron que gicina A posee un efecto bactericida sobre bacterias Gram positivo y que este efecto es producido por una permeabilización en la membrana celular. La evaluación de la citotoxicidad in vitro de gicina A sobre células eucariontes mostró que esta bacteriocina ejerce una leve toxicidad en las líneas de origen tumoral, sin embargo no se observó efecto citotóxico sobre las líneas celulares no tumorales.

Bacteriocins are antimicrobial peptides ribosomally synthesized produced by microorganisms, mainly from Bacteria domain. Bacteriocins produced by Gram positive or Gram negative bacteria, present a toxic activity on bacterial species closely related to the bacteriocin producing bacteria. To exert its antimicrobial action, bacteriocins use specific receptors exclusively located in the target bacteria, therefore rarely cytotoxic activity on eukaryotic cells can be observed. However, some bacteriocins specifically inhibit growth of neoplastic cell lines. Because of these properties, bacteriocins have a potential for biotechnological application for its possible use as an alternative to the traditional antibiotic treatments, or as new antibiotics against multi-resistant pathogens, also as preservatives or disinfectants in food industry, and in biomedical field as antineoplastics. In our laboratory we have found a new antibacterial compound with bacteriocin properties produced by the Pseudomonas aeruginosa O400 strain, which we called gicin A. This compound is able to selectively inhibit the growth of Gram positive bacteria. Because there are no reports in the literature of bacteriocins produced by Gram negative bacteria that have antimicrobial activity only on Gram-positive bacteria, the study of the mechanism of action and biochemical properties of gicin A is a very valuable contribution to the search of new antimicrobial substances. The overall aim of this thesis was to “Purify, characterize biochemically, and assess both the antibacterial action mechanism of gicin A, and its in vitro toxicity on eukaryotic cell lines”. To achieve this objective the purification of gicin A was performed by a hydrophobic column chromatography and HPLC. Protein electrophoresis and mass spectrometry determined that this protein has a molecular mass of 7925 Da. The evaluation of its biochemical properties showed that the activity of gicin A is stable at a wide temperature range, it retains its activity when is solubilized in a wide range of solvents and has a higher activity when is solubilized at a neutral pH. Moreover, employing purified gicin A was confirmed that it has a selective antibacterial activity against Gram positive bacteria. Alteration studies of the growth kinetics of the target bacteria and fluorescence microscopy indicated that gicin A has a bactericidal effect on Gram positive bacteria and that this effect is produced by cell membrane permeabilization. The evaluation of cytotoxicity in vitro of gicin A on eukaryotic cells shows that this bacteriocin has a mild toxicity on tumoral origin cell lines, however we noticed no cytotoxic effect on non tumoral origin cell lines.