Efectos de fluoxetina sobre las sinapsis excitadoras telencefálicas y sobre modelos de depresión inducida por estrés

Abstract

En la depresión mayor, la remisión de los síntomas depresivos mediante el uso de fármacos antidepresivos (FADs) requiere de la administración prolongada de éstos. El retardo necesario para observar el efecto terapéutico sugiere que necesariamente deben inducirse procesos neuroadaptativos de curso temporal lento. Diversos antecedentes muestran que en pacientes deprimidos y en modelos animales de esta enfermedad, que se basan en la exposición repetitiva a estrés, se alteran las neuronas y sinapsis glutamatérgicas. Estos cambios deberían ser revertidos por FADs como fluoxetina (flx), un inhibidor específico de la recaptación de serotonina, o reboxetina (rbx), un inhibidor específico de la recaptación de noradrenalina. Por ello, la hipótesis de esta tesis fue que “La administración prolongada de FADs en ratas sometidas a estrés repetido revierte los síntomas depresivos e induce cambios morfológicos y moleculares en neuronas y sinapsis glutamatérgicas del telencéfalo”. Para evaluar esta hipótesis, se indujo estrés por reducción de movimiento empleando dos protocolos semejantes, la restricción en pequeñas cajas o la inmovilización en bolsas durante dos horas diarias por 10 días. En ambos casos, se observaron conductas tipo depresivas. Luego, se administró durante 4 semanas dos diferentes dosis de flx o rbx, continuando el protocolo de estrés durante este período. Las conductas depresivas evaluadas fueron ansiedad y desesperanza aprendida. A pesar de que ambos protocolos de estrés indujeron un aumento de los síntomas, éstos fueron revertidos diferencialmente: flx revierte preferencialmente los síntomas depresivos inducidos por restricción, mientras rbx revierte los síntomas depresivos inducidos por inmovilización. Interesantemente, este efecto se observó sólo a las concentraciones menores utilizadas de ambos fármacos. Adicionalmente, se observó que la administración de flx a ratas naïve indujo una disminución de la desesperanza. Para estudiar los cambios plásticos inducidos por flx que podrían dar cuenta de este efecto antidepresivo, estudiamos las sinapsis glutamatérgicas en ratas naïve tratadas con flx 0,7 mg/kg por 4 semanas. Se evaluó mediante tinción de Golgi la morfología de las dendritas, la densidad y la forma de las espinas dendríticas, y mediante inmunohistoquímica el número de células positivas para las subunidades de receptores glutamatérgicos: GluA1 y GluA2 del R-­‐AMPA y GluN1, GluN2A y GluN2B del R-­‐NMDA en las siguientes áreas telencefálicas: la corteza retroesplenial (RSGb), corteza Prelímbica (PrL) y la corteza motora secundaria (M2) y el hipocampo. Flx indujo retracción del árbol dendrítico y aumento de la densidad y del porcentaje de espinas más grandes. Una de las áreas más afectadas por flx fue la corteza retroesplenial, un área cortical implicada en memoria espacial. A través de las mediciones de permeabilidad al calcio a través del R-­‐AMPA en el hipocampo observamos que flx aumentó la presencia de R-­‐AMPA impermeables al catión, constituidos por la subunidad GluA2. Estos hallazgos reflejan que flx favorece la presencia de contactos sinápticos más maduros que deberían limitar la plasticidad de los circuitos corticales afectados. Para evaluar las consecuencias funcionales de los cambios plásticos en las sinapsis gluatamatérgicas inducidos por flx, realizamos pruebas de memoria dependiente del hipocampos (Prueba del Laberinto de Morris) y parcialmente dependiente de esta estructura (Prueba de Reconocimiento de Objetos). En ambas pruebas, flx indujo un deterioro significativo en la consolidación de la memoria, no así en la adquisición. Sin embargo, no se encontró alteración en memorias que dependen de otras estructuras, como la amígdala. Los resultados mostrados en esta tesis nos permiten concluir que los mecanismos neurobiológicos que se inducen por diferentes modelos de estrés repetido son particulares y por lo tanto, son diferencialmente sensibles a FADs que pertenecen a diferentes familias de fármacos. Esto sugiere que pacientes con sub-­‐tipos de depresión podrían responder diferencialmente a FADs serotoninérgicos o noradrenérgicos. Por otra parte, en ratas naϊve tratadas con flx, los circuitos glutamatérgicos presentan signos de mayor madurez y menor plasticidad frente a un estímulo posterior. Esta menor plasticidad se acompaña por un deterioro en la consolidación o almacenamiento de la memoria. Esta tesis significa un avance importante para el conocimiento de sub-­‐tipos de depresión, los efectos de la administración prolongada de flx sobre sinapsis glutamatérgicas y sus posibles efectos negativos sobre la memoria en sujetos sanos. Estos estudios permitirán plantear, en el futuro, el uso de biomarcadores para el diagnóstico objetivo de subtipos de depresión e intervenciones terapéuticas para su tratamiento.

The remission of depressive symptoms in major depression needs long-­‐term antidepressant drugs (ADDs) administration. The delay required to obtain the therapeutic effect suggests that neuroadaptive processes, occuring with a slow time course, are necessary. Several reports show that in depressed patients and animal models of the disease, based on repeated exposure to stress, glutamatergic neurons and synapses are modified. These changes should be reverted by ADDs such as fluoxetine (flx), a specific serotonin re-­‐uptake inhibitor, or reboxetine (rbx), a specific noradrenaline re-­‐uptake inhibitor. Therefore, the hypothesis of the present thesis work is: Long-­‐term administration of ADDs (flx or rbx) to rats subjected to repetitive stress revert depressive symptoms and morphological and molecular changes in glutamatergic neurons of forebrain areas. To test this hypothesis, stress was induced by restraint stress in wire mesh cages or by immobilization in plastic bags for 10 days to observe depressive symptoms. Then, flx or rbx were administered at two different doses daily for 28 days during which the stress protocol was continued. Depressive-­‐like symptoms such as learned helplessness and anxiety were assessed by behavioral tests. Both stress models induced depressive symptoms such as increased anxiety and learned helplessness, which were differentially reversed: flx preferentially reversed depressive symptoms induced by restriction, while rbx reversed depressive symptoms induced by immobilization. To study plastic changes induced at glutamatergic synapses, naϊve rats were treated with 0.7 mg/kg of flx for 28 days. The dendritic length, spine density and morphology were studied by the Golgi silver staining method whereas levels of AMPA-­‐R subunits (GluA1 and GluA2) and NMDA-­‐R subunits (GluN1, GluN2A and GluN2B) were assessed by immunohistochemistry in the following forebrain areas: Prelimbic cortex (PrL), Retrosplenial cortex (RSGb) and Secondary Motor cortex (M2) and in the hippocampus. Flx induced dendritic retraction and increases in dendritic spine density and in large spines. The most affected area was RSGb, a cortical area involved in spatial memory. Through the measurements of calcium permeability through AMPA-­‐Rs in hippocampal slices, we observed that flx increased the levels of GluA2-­‐lacking AMPA-­‐R. These findings indicate that flx induced a maturation or potentiation of synaptic contacts that should limit the plasticity of the affected cortical circuits. To evaluate plasticity, we performed tests of hippocampal memory (Morris Water Maze) as well as of partially hippocampus-­‐dependent memory (novel object recognition test). In both, flx induced a significant impairment in memory consolidation, but not in acquisition. Our findings show that the neurobiological mechanisms that are induced by repeated stress models are unique to the used stress protocol and interestingly, they are differentially sensitive to ADDs belonging to different drug families. This suggests that sub-­‐ types of depression in human subjects should respond preferentially to serotoninergic or noradrenergic ADDs. Moreover, naϊve glutamatergic synapses are characterized by more mature and less plastic synaptic contacts. Their putative lower plasticity is associated with impairment in memory consolidation or storage. This thesis represents a significant advance in understanding of sub-­‐types of depression and the deleterious effects of long-­‐ term flx treatment in healthy subjects. Moreover, the molecular adaptations at glutamatergic synapses described in this work allow the proposal of new therapeutic strategies for the treatment of depression.