Determinantes de resistencia a cobre presentes en acidithiobacillus ferrooxidans

Abstract

Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria extremófila de gran importancia industrial debido a su participación en la recuperación de metales como cobre, oro y uranio en biominería. Esta bacteria puede resistir altas concentraciones de cobre y otros metales, característica fundamental para sobrevivir a las condiciones de la biolixiviación de minerales. La presencia en A. ferrooxidans ATCC 23270 de determinantes de resistencia a cobre canónicos (bombas de eflujo, chaperonas que unen cobre, etc) no explican completamente cómo esta bacteria resiste concentraciones de cobre extremas, sugiriendo la existencia de otros mecanismos de resistencia al metal. Para identificar nuevos posibles determinantes de resistencia en este microorganismo, se evaluó los niveles de síntesis de proteínas por análisis proteómico por electroforesis bidimensional (IEF-SDS PAGE) y también se determinó los niveles de mRNA de algunos genes que codifican estos determinantes por PCR en tiempo real (qRT-PCR). Además, mediante proteómica cuantitativa por ICPL (isotope-coded protein labeling) se identificó 366 proteínas de las que 47 cambian sus niveles de síntesis en células crecidas en azufre en presencia de cobre, mientras que en hierro se identificó 594 proteínas de las que 120 cambian en presencia del metal. Mediante esta estrategia se identificó la sobreexpresión de proteínas de membrana que forman parte de un sistema Cus y un sistema de eflujo del tipo RND diferente en A. ferrooxidans crecidos en presencia de cobre, sugiriendo un eflujo dinámico de cobre a través de las membranas. Además se observó la sobreexpresión de la mayoría de los genes involucrados en la síntesis de histidina y de varios genes que participan en la síntesis de cisteína, indicando una posible función de estos aminoácidos que unen metales en la destoxificación del cobre intracelular. También se detectó el aumento en la síntesis de una posible disúlfuro isomerasa periplasmática, indicando que esta proteína repararía puentes disúlfuro dañados para permitir la supervivencia celular en condiciones de estrés. Por otro lado, se observó la represión de la porina de membrana externa más abundante de A. ferrooxidans (Omp40) y de otros canales iónicos, lo que sugiere una disminución del influjo del metal hacia el interior de la célula. Finalmente, se identificó en A. ferrooxidans crecidos en azufre y en presencia de cobre un incremento en la síntesis de algunas proteínas relacionadas con la formación de biopelículas. Esto sugiere que el crecimiento de la bacteria adherida a un medio sólido mejoraría la resistencia al cobre del microorganismo. Los resultados obtenidos indican que A. ferrooxidans usaría no sólo estrategias canónicas de resistencia a cobre como sistemas del tipo RND, sino que también mecanismos adicionales en los que varias proteínas de la envoltura celular y citoplasmáticas serían componentes principales. Por medio de este trabajo se identificó nuevas proteínas que participarían en la resistencia a cobre en A. ferrooxidans contribuyendo a mejorar el conocimiento sobre los mecanismos de resistencia a este metal de esta bacteria, lo que podría proporcionar las herramientas para optimar la resistencia a cobre de otros microorganismos biomineros y la eficiencia del proceso de biolixiviación

Acidithiobacillus ferrooxidans is an extremophilic bacterium of great industrial importance due to its participation in the recovery of metals such as copper, gold and uranium through biomining. This bacterium is able to resist high copper and other metal concentrations, an essential property to survive the environmental conditions during industrial ore bioleaching. The presence in A. ferrooxidans ATCC 23270 of canonical copper-resistance determinants (efflux pumps, metal chaperones, etc) do not fully explain how this bacterium is able to resist extreme copper concentrations, suggesting the existence of other mechanisms of resistence. To identify new possible copper resistance determinants in A. ferrooxidans ATCC 23270, levels of protein synthesis were determined by proteomic analysis through two-dimensional electrophoresis (IEF-SDS PAGE). In addition, the RNA levels of some genes encoding these putative resistence determinants was also measured by real-time PCR (qRT-PCR). Furthermore, through quantitative ICPL (isotopecoded protein labeling) proteomics 366 proteins we identified of which 47 changed their levels of synthesis in cells grown in sulfur in the presence of copper while in iron grown cells 594 proteins were identified. One hundred and twenty of then changed their levels in the presence of copper. Using this strategy the up-regulation of membrane proteins that are part of RND-type Cus systems and new different RND-type efflux pumps were identified in A. ferrooxidans grown in the presence of copper, suggesting a dynamic metal efflux through the membranes. Furthermore, the overexpression of most genes involved in histidine biosynthesis and several genes involved in the biosynthesis of cysteine was observed, suggesting a possible role of these metal-binding amino acids in detoxifying of intracellular copper. In addition, the up-regulation of a putative periplasmic disulfide isomerase was also seen in the presence of copper, suggesting that this protein would restore damaged disulfide bonds to allow cell survival in stress conditions. On the other hand, the down-regulation of the major outer membrane porin (Omp40) and some ionic transporters observed in A. ferrooxidans grown in the presence of copper indicated a general decrease in the influx of the metal and other cations into the cell. Finally, in A. ferrooxidans grown in sulfur and in the presence of copper, an increase in the synthesis of some proteins related to biofilm formation was found. This suggests that growth of bacteria adhered to a solid medium may enhance copper resistance of this microorganism. The results indicate that A. ferrooxidans would use not only canonical strategies of resistance to copper such as RND-type systems, but also additional mechanisms where several proteins of the cell envelope and cytoplasm would be main components. Through this work we identified novel proteins that participate in copper resistance in A. ferrooxidans contributing to a better understanding of the mechanisms of copper resistance of this bacterium, which could provide the tools to improve copper resistance to other biomining microorganisms and bioleaching process efficiency