Evaluación del ingreso de esteroides sulfatados y su metabolización intracelular : implicancia en el proceso de proliferación celular en células endometriales de mujeres con síndrome de ovario poliquístico

Abstract

El endometrio es un tejido que requiere de la acción de los esteroides para su correcta función; de modo que patologías que alteren la concentración de esteroides inducen fallas en la fisiología endometrial, como es el caso del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS). Los endometrios de mujeres con PCOS (PCOSE) presentan un incremento de los procesos de proliferación celular, caracterizados por altos niveles de proteínas ciclina D1, Ki67 y disminución de p27. En este contexto, se sabe que los estrógenos generan efectos pro-proliferativos en el tejido endometrial. Los esteroides pueden ser originados por la metabolización intratisular (origen intracrino) desde precursores como la DHEAS que son convertidos en esteroides con actividad estrogénica y/o androgénica. Para esto se requiere que los precursores sulfatados ingresen a las células a través de transportadores de las familias OATPs y OATs. Además, se necesita la expresión y actividad de enzimas que metabolizan los esteroides. Previamente, hemos reportado que en PCOSE existe un incremento en la metabolización de DHEA a androstenediol, un metabolito con actividad estrogénica. En el presente trabajo se propuso como objetivo general evaluar si el ingreso a la célula de esteroides sulfatados a través de transportadores y su metabolización intracelular está alterado en endometrio de mujeres con PCOS. Además, establecer si esto genera altas concentraciones intracelulares de esteroides que permitan el incremento del proceso de proliferación celular. Para ello, se propuso dos modelos, uno ex vivo y un modelo in vitro con células de la línea T-HESC, St-T1b y células endometriales obtenidas desde cultivo primario. Para el primer objetivo específico se determinó que existe un incremento de los niveles de androstenediol en PCOSE al compararlo con controles (CE) (p=0,002). Además, se evaluó la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) en los tejidos en estudio, no detectándose diferencias significativas. En el segundo objetivo específico se analizó la expresión y actividad de los transportadores OATP-B, D y E, y OAT4 en el modelo ex vivo e in vitro, por western blot, RT-PCR convencional y ensayo de captación de DHEAS. En el modelo in vitro se utilizó estímulos con androstenediol, testosterona y estradiol. Se determinó que los niveles proteicos de los transportadores OATP-B y OATP-E están incrementados en PCOSE versus CE (p=0,049 y p=0,007, respectivamente). Los ensayos in vitro de la actividad de transportadores nos permitieron determinar que existe un menor ingreso de DHEAS en células estimuladas con testosterona (p=0,02). Los niveles proteicos de OATP-E se ven disminuidos con los estímulos de androstenediol y testosterona (p=0,04 y p=0,04, respectivamente). El tercer objetivo tenía la finalidad de determinar si altas concentraciones de esteroides (androstenediol, testosterona y estradiol) por 48 h modifican los procesos de proliferación celular en células de la línea T-HESC y St-T1b. Para esto se utilizó las técnicas de western blot, inmunocitoquímica y citometría de flujo. Se determinó que estímulos con estradiol y androstenediol incrementan los niveles de ciclina D1 (p<0,05) y disminuyen los niveles del represor de ciclo celular p27 (p<0,05); además, androstenediol aumenta el porcentaje de núcleos positivos a Ki67 en células St-T1b (p=0,05). Por otro lado, el estímulo con testosterona por 48 h disminuye los niveles de Ki67 y de ciclina D1, e incrementa los de p27 (p<0,05). Sin embargo, estos estímulos no modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular, evaluado por citometría de flujo. Finalmente, con el cuarto objetivo se evaluó los posibles mecanismos involucrados que generarían los cambios en las moléculas reguladoras del ciclo celular dadas en el modelo in vitro. Para eso, mediante la técnica de western blot, se evaluó las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K/Akt, además se utilizó inhibidores de estas vías, antagonistas de receptores de estrógenos y andrógenos, y un inhibidor de RNA polimerasa II. Se determinó que androstenediol es capaz de incrementar los niveles de fosforilación de ERK1/2 y de Akt con los estímulos de 48 h (p<0,05), pero no así con estímulos de 20 min. Por otro lado, testosterona por 48 h disminuye la activación de la vía PI3K-Akt (p<0,05). La utilización de antagonistas de receptores de estrógenos (ICI 182,780 y MPP dihidrocloruro), nos permitió determinar que el efecto sobre p27 y ciclina D1 sería a través del receptor de estrógenos (ER) α (p<0,05). Adicionalmente, los cambios en las fosforilaciones desaparecen cuando está presente un inhibidor de la RNA polimerasa II (α-amanitina) (p<0,05), por lo que probablemente requiere de la transcripción de alguna o algunas proteína/s que permitan los cambios observados en los reguladores del ciclo celular. Para determinar si se requiere las vías de PI3K/Akt ó MAPK (ERK1/2), se utilizó inhibidores de PI3K (LY-194,002) y MEK1/2 (U-0126). La presencia de LY-194,002 inhibe los cambios dados por androstenediol en ciclina D1 y p27 (p<0,05), mientras que U-0126 evita solo el incremento de ciclina D1 dado por androstenediol (p<0,05). Por lo tanto, la fosforilación de Akt sería relevante para la modulación de ambas vías reguladoras del ciclo, mientras que la fosforilación de ERK1/2 sería necesaria solo para ciclina D1. El presente trabajo propone diversas metodologías para caracterizar a través de qué mecanismo se genera el incremento en la proliferación celular presente en PCOSE y el rol que tiene la intracrinología en estas alteraciones, donde androstenediol tendría un rol relevante. Los resultados obtenidos en los estudios in vitro nos permiten concluir que androstenediol potenciaría la proliferación celular, actuando como un estrógeno en nuestro modelo, a través del ER α, y que río abajo se activen las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K-Akt. Esto explicaría, en parte, la desregulación del proceso proliferativo ocurrido en PCOSE y la fisiopatología de la hiperplasia y adenocarcinoma endometrial de alta prevalencia en las mujeres con este síndrome

The endometrium is a tissue that requires the action of steroids for its adequate function; therefore, pathologies altering the concentration of steroids induced endometrial physiology failures, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS). Previous reports have indicated that the endometrium of women with PCOS (PCOSE) show increased cell proliferation processes, characterized by high levels of cyclin D1 protein, Ki67 and p27 decreased. In this context, it is known that estrogens enhance proliferation of endometrial tissue. The intratisular steroid metabolism (intracrine) from precursors such as DHEAS could convert into steroids with oestrogenic and/or androgenic activity. This requires sulfated precursors entering the cells through transporters OATs and OATPs families. Furthermore, expression and activity of steroid metabolizing enzymes is needed. We have previously reported in PCOSE an increased DHEA metabolism to androstenediol, a metabolite with estrogenic activity. In this work, it was proposed as a general objective to evaluate whether DHEAS entry the cell via sulfated steroid transporters and if intracellular metabolism is altered in the endometrium of women with PCOS. Furthermore, to establish whether this generates high intracellular concentrations of steroids that could allow the increased in the cell proliferation process. To achieve this, we proposed two models, an ex vivo and an in vitro cell line model of T-HESC and St-T1b and also, endometrial cells obtained from primary cultures. The results of the first specific objective show a significative increase in PCOSE androstenediol levels compared to controls (EC) (p=0.002). Moreover, no significant differences were detected in the activity of the enzyme 3β-HSD in the tissues under study. In the second objective, the expression and activity of transporters OATP-B, D and E, and OAT4 was tested in the model ex vivo and in vitro, western blot, RT-PCR and conventional DHEAS uptake assay. In the in vitro model, stimuli with androstenediol, testosterone and estradiol were used. It was determined that the protein levels of the transporters OATP-B and OATP-E are increased in CE versus PCOSE (p=0.049 and p=0.007, respectively). In vitro activity of transporters assays allowed us to determine that there is less uptake of DHEAS in testosterone stimulated cells (p=0.02). Protein levels of OATP-E are diminished with androstenediol and stimuli of testosterone (p=0.04 and p=0.04, respectively). The third objective aimed to determine whether high levels of steroid (androstenediol, testosterone and estradiol) for 48 h modified the cell proliferation process in T-HESC and St-T1b cell lines. To achieve this purpose, western blot, immunocytochemistry and flow cytometry techniques were used. It was determined that estradiol and androstenediol stimuli increase levels of cyclin D1 (p<0.05) and lower levels of the cell cycle repressor p27 (p<0.05); additionally, androstenediol increases the percentage of positive nuclei for Ki67 in St-T1b cells (p=0.05). On the other hand, stimulation with testosterone for 48 h affected negatively the levels of Ki67 and Cyclin D1 and positively p27 levels (p<0.05). However, these stimuli do not modify the percentage of cells in the different phases of the cell cycle assessed by flow cytometry. Finally, the fourth objective evaluated some possible mechanisms involved in changes in cell cycle regulatory molecules given in the in vitro model. For this, MAPK (ERK1/2) and PI3K/Akt levels and activity were evaluated by Western blotting. We used inhibitors of these pathways, estrogens and androgens receptors antagonists, and an inhibitor of RNA polymerase II. Androstenediol was able to increase the levels of ERK1/2 and Akt phosphorylation with the stimulus of 48 h (p<0.05), but not with stimuli of 20 min. Moreover, 48 h-testosterone stimulation decreased the activation of the PI3K-Akt (p<0.05) pathway. The use of estrogen receptor antagonists (ICI 182,780 and MPP dihidrocloruro), allowed us to determine that the effect on p27 and cyclin D1 would be through the estrogen receptor α (p<0.05). Additionally, those changes in phosphorylation disappeared when an inhibitor of RNA polymerase II (α-amanitin) was used (p<0.05). These data indicate requirement of transcription or some protein/s that allow the observed changes in cell cycle regulators. To determine whether PI3K/Akt or MAPK (ERK1/2) is required, PI3K (LY-194.002) and MEK1/2 (U-0126) inhibitors were used. The presence of LY-194.002 inhibits changes given by androstenediol in cyclin D1 and p27 (p<0.05), while U-0126 only prevents the increase of cyclin D1 given androstenediol (p<0.05). Therefore, the phosphorylation of Akt could be relevant for both modulation cycle regulatory pathways, while phosphorylation of ERK1/2 would be required only for cyclin D1. This paper proposes several methods to characterize the mechanism involved in the increased cell proliferation observed in PCOSE, where intracrinology has a role in these alterations, particularly androstenediol could have a significant role. The results obtained in the in vitro studies allow us to conclude that androstenediol could enhance cell proliferation, acting as an estrogen in our model, through estrogen receptor α, where MAPK (ERK1/2) and PI3K-Akt pathways are activated. This could explain, in part, the deregulation occurred in PCOSE proliferative process and the pathophysiology of high prevalence of endometrial hyperplasia and adenocarcinoma in women with this pathology