Análisis molecular y bioinformático de un marcador de sexo de Broussonetia papyrifera (L.) L'Herit. ex Vent

Abstract

La morera de papel (Broussonetia papyrifera (L.) L´Herit. ex Vent) es una planta dioica nativa del sudeste asiático, donde se cultiva y utiliza con fines medicinales y como fuente de fibra para la fabricación de papel. Esta especie fue introducida en Oceanía también como fuente de fibra para la fabricación de textiles. Dado el valor económico diferencial de los individuos de morera de papel en China, investigadores de ese país desarrollaron un marcador de sexo de esta planta en base a la técnica de AFLP. Este marcador corresponde a una secuencia de 425 pares de bases. A partir de esta secuencia en nuestro laboratorio se desarrolló un protocolo de PCR dúplex que permite determinar el sexo de B. papyrifera, de modo de generar dos productos de amplificación en individuos masculinos y uno en individuos femeninos. El control interno de este experimento está determinado por el producto PCR de aproximadamente 425 pb, amplificado tanto en individuos masculinos como femeninos. La secuenciación de este producto PCR fue posible en individuos femeninos, pero no en ejemplares de plantas masculinas, probablemente debido a la presencia de más de un producto de amplificación. El marcador de sexo es por tanto, diferente en individuos de distinto sexo de B. papyrifera. En base a estos antecedentes se planteó la siguiente hipótesis: “El marcador de sexo de B. papyrifera representa una región de DNA funcional que está involucrado en expresión génica diferencial.” Para verificar la hipótesis se planteó como objetivo caracterizar la secuencia correspondiente al marcador de sexo de B. papyrifera en individuos de ambos sexos, e identificar características de elementos regulatorios en cis implicados en una expresión génica diferencial, los que podrían promover el desarrollo de fenotipos masculinos y femeninos en esta especie dioica. Los análisis con este marcador molecular de sexo se realizaron con el material genético de muestras foliares del banco genómico del Laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile. Se amplificó el marcador de sexo de B. papyrifera de 6 ejemplares femeninos provenientes de Taiwán, Hawái, Vietnam, Rapa Nui y China y seis ejemplares masculinos de Taiwán, Hawái, Vietnam y China. Se clonaron los productos de amplificación para separar las distintas secuencias presentes en cada uno de los individuos. Los clones se secuenciaron y alinearon entre sí, revelándose una multiplicidad de variantes del marcador de sexo en cada individuo. Las secuencias de los individuos masculinos presentan mayor diversidad genética que las secuencias de individuos femeninos, resultado que se confirmó mediante la construcción de dendrogramas, donde algunas secuencias masculinas formaron clados separados. Por el contrario, las secuencias correspondientes a individuos femeninos poseen una diversidad genética menor. La ausencia de producto de amplificación en otras especies cercanas (Moráceas), sugiere que el marcador de sexo de B. papyrifera es especie específico. La búsqueda de secuencias homólogas indicó que el marcador de sexo no posee homólogos depositados en GenBank. Al no existir secuencias para comparar estructura y función, se realizó un análisis no canónico de búsqueda de funcionalidad de las secuencias del marcador de sexo de B. papyrifera en base a la metodología descrita por Lobos y cols. (2010). En la presente memoria se utilizó la suite MEME para buscar motivos con posible significancia biológica en las secuencias analizadas. Luego, una vez identificados 15 motivos, se buscaron genes de Saccharomyces cerevisiae y Arabidopsis thaliana que poseen los motivos encontrados en el marcador de sexo de B papyrifera. Los resultados de este análisis indican que las secuencias del marcador de sexo varían en su composición de motivos. Las secuencias masculinas y femeninas comparten los 15 motivos, sin embargo dos de estos motivos están ausentes en determinados secuencias de individuos masculinos. Estas mismas secuencias forman un clado separado en el dendrograma. Los motivos identificados en el marcador de sexo de B. papyrifera se encontraron en diversos genes de A. thaliana y S. cerevisiae, los cuales podrían estar implicados en el desarrollo de fenotipos diferenciados. También se identificaron los factores de transcripción de S. cerevisiae que se unen a dichos motivos del marcador de sexo de B. papyrifera. Estos factores de transcripción son de carácter global y regulan diversas funciones en S. cerevisiae, aportando información al análisis predictivo presentado en esta memoria. Los datos de las bases de datos de S. cerevisiae, sugieren que existen múltiples factores de transcripción que se unirían a la secuencia del marcador de sexo de B. papyrifera. De este modo el trabajo realizado sugiere un rol hipotético de regulador de la expresión génica y además valida el modelo analítico empleado en esta memoria. En el futuro será de interés analizar el contexto genómico de la secuencia estudiada y estudiar in vitro la unión de factores de transcripción para comprobar experimentalmente la unión proyectada in silico en esta memoria

Paper mulberry (Broussonetia papyrifera (L.) L´Herit. ex Vent) is a dioecious plant native of Southeast Asia, where it is grown and used for medicinal purposes and as a source of fiber for making paper or textiles. This species was introduced into Oceania by the ancient Polynesian voyagers also for making textiles. Given the distinct economic value of male and female B. papyrifera individuals in China, Chinese investigators developed a sex marker based on AFLP, corresponding to a 425 bp sequence. Using this sequence as a starting point, a PCR duplex protocol was developed in our laboratory that allows the assessment of gender of B. papyrifera plants. In male plants two amplification products are obtained, while only one amplification band is observed in female plants. The 425 bp amplification product observed in both male and female individuals corresponds to an internal control. Sequencing of this PCR product was possible only in female samples, probably due to presence of more than one amplification product in male plants. Based on these results, we proposed the following hypothesis: "The sex marker of B. papyrifera is a functional DNA region involved in differential gene expression". The goal of this work was to characterize the sequence of this sex marker in several individuals sampled in Asia and in the Pacific, and to identify putative regulatory cis elements involved in differential gene expression, which may define male and female phenotypes in this dioecious species. DNA extracted from leaves and stored in the genomic bank of the Molecular Biology Laboratory, Faculty of Chemical and Pharmaceutical Sciences, University of Chile was used for all analyses. The B. papyrifera sex marker of six female samples from Taiwan, Hawaii, Vietnam, Rapa Nui and China and of six male samples from Taiwan, Hawaii, Vietnam and China was amplified. These amplification products were cloned to resolve the distinct sequences present in each sample. Clones were sequenced and aligned, revealing multiplicity of sex marker sequences in each sample. Male sequences presented higher genetic variability than female sequences, as seen in dendrograms, as only male sequences cluster in separated groups. The results of this study identified thirty five distinct versions of the sex marker sequence, from a total of forty nine sequences. The absence of amplification products in closely related species (Moraceae), suggests that the B. papyrifera sex marker may be species‐specific. A search for homologous sequences in the GenBank database did not identify any similar sequence. As no homologous sequences are available to compare structure and function, a non‐canonical analysis was performed to search for functionality of the B. papyrifera sex marker (Lobos et al., 2010). In this thesis, suite MEME was used to search for motifs of biological significance. Results showed that the sex marker sequences contain 15 motifs that are shared by male and female sequences, although two motifs are absent in some male sequences. These sequences also cluster in separate groups in Kimura 80 dendrograms. Next, identified motifs were searched in Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana gene databases containing these motifs. The identified motifs were found in a number of S. cerevisiae and A. thaliana genes which are involved in the development of differentiated phenotypes. Also, transcription factors (TFs) that bind to these motifs in the sex marker sequence were identified. These TFs regulate diverse functions in S. cerevisiae, adding information to the predictive analysis of this work. These results indicate that the sex marker of B. papyrifera corresponds to several genomic sequences, where male sequences present higher genetic deversity than female sequences, as revealed by identity percentages and dendrograms. The sequences found are distinct among female and male sequences. In addition, the sequences derived from male samples that lack the two of the 15 motifs, cluster in separate groups. To summarize, the data from the S. cerevisiae database suggest the presence of TF binding sites in motifs within the sequence of paper mulberry sex marker. Therefore, this work suggests a possible role for this sequence as a regulator of gene expression and also validates the analytical model employed in this thesis. It will be interesting to analyze the genomic context of the sex marker sequence and evaluate the binding of these transcription factors in vitro, to experimentally verify the proposed in silico binding