Caveolina-1 favorece la activación de rab5 promoviendo la migración y la activación del eje p85α/tiam1/rac-1 en células de cáncer metastásico y en un modelo de metástasis in vivo en ratones c57bl/6

Abstract

El cáncer constituye una de las principales causas de muerte en Chile y el mundo. Particularmente, la agresividad de esta enfermedad subyace en la diseminación de las células tumorales hacia otros tejidos, fenómeno conocido como metástasis. La metástasis es un proceso multifactorial, siendo la migración celular una de las etapas más relevantes. Caveolina-1 es una proteína de membrana que en etapas avanzadas del cáncer aumenta su expresión y promueve la migración celular y metástasis. En este contexto, Caveolina-1 ha sido asociada a un conjunto de cambios morfológicos esenciales que permiten la migración e invasión celular, entre estos, la remodelación del citoesqueleto de actina y el recambio de complejos de adhesión celular. Muchos de estos eventos dependen del tráfico endosomal, el cual a su vez es finamente regulado por diversos factores y moléculas, como las GTPasas pequeñas de la familia Rab. Una de estas proteínas es Rab5, la cual no sólo actúa como regulador maestro de la endocitosis temprana, sino que además cumple un rol fundamental en la migración celular. Trabajos recientes han descrito que la interacción entre Rab5 y Caveolina-1 influye en el tráfico endosomal, sin embargo el rol de esta interacción en la migración celular no había sido investigado. Entre los reguladores de Rab5, p85α (la subunidad reguladora de PI3K), se caracteriza por inhibir a Rab5, ya que posee un dominio RabGAP que estimula su actividad GTPasa. Literatura reciente ha descrito una interacción funcional entre p85α y Caveolina-1, la cual a su vez depende de la fosforilación de Caveolina-1 en tirosina (Y14). Lo anterior cobra relevancia, ya que Caveolina-1 ejerce muchos de sus efectos en migración celular mediante la fosforilación en este residuo. Por otro lado, trabajos recientes indican que Rab5 activa a Rac-1, a través del reclutamiento de la GEF Tiam1, fomentando la formación de lamellipodios y la polimerización de actina en sitios específicos de membrana. Además, trabajos de nuestro laboratorio demostraron que Caverolina-1 promueve la activación de Rac-1 en células metastásicas. Todos estos eventos llevan a que la célula adquiera cambios morfológicos que le permiten migrar. Por lo tanto, es importante investigar el papel potencial que desempeñaría Caveolina-1 en la regulación de este circuito, así como su relevancia en la migración celular. En esta tesis, se investigó los mecanismos asociados al efecto promotor de migración y metástasis de Caveolina-1, identificando un nuevo eje de señalización “p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1”. A su vez, se evaluó la relevancia de este eje en un modelo preclínico, evaluando la metástasis in vivo en ratones C57BL/6. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis indican que Caveolina-1 promueve la migración, invasión y la activación de Rab5 en tres líneas celulares metastásicas: HT-29(US) de cáncer de colon, B16-F10 de melanoma murino y MDAMB- 231 de cáncer de mama. En relación a esto último, la expresión de Caveolina-1 promueve un aumento en el tamaño de los endosomas tempranos, pero no debido a la estabilización de Rab5 en éstos, sino que debido al secuestro de p85α en un complejo proteico. Interesantemente, el efecto de p85α en la inhibición de Rab5 es asociado a su actividad GAP, y no involucra la activación de PI3K. Mediante ensayos de silenciamiento y reconstitución, se observó que la expresión y actividad de Rab5 son fundamentales para que Caveolina-1 promueva migración e invasión celular, así como también la activación de Rac-1. La activación de Rac-1 por Caveolina-1 y Rab5 requiere de Tiam1, la cual es reclutada a endosomas tempranos de manera dependiente de Caveolina-1. Finalmente, se demostró que Caveolina-1 requiere de Rab5, p85α y Rac-1 para promover invasión in vitro y metástasis in vivo en ratones C57BL/6. De esta manera, este trabajo de tesis aporta nueva evidencia acerca de los mecanismos moleculares involucrados en la migración y metástasis inducida por Caveolina-1, proponiendo un nuevo eje de señalización p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1, el cual involucra proteínas comúnmente alteradas en cáncer, y por lo tanto, contribuyendo con la identificación de nuevos blancos potenciales terapéuticos

Cancer is a leading cause of disease in Chile and worldwide. During the development and progression of this disease, normal cells convert to the cancerous state by acquiring specific characteristics. Of these metastasis is widely considered particularly important because it is this trait of cancer cells that is responsible for the large majority of deaths in cancer patients. Caveolin-1 is a membrane protein with vastly differing roles in cancer that range from functioning as a tumor suppressor to promoting tumor cell migration invasion and metastasis. Concomittant with this unfavorable role in tumor progression, expression of this protein frequently increases in advanced stages of cancer and is viewed there as a marker for poor patient prognosis and survival. In this cellular context, it is important to gain better insight to how Caveolin-1 promotes the acqusition of a more invasive cellular phenotype. In these migration-related events, endosomal trafficking reportedly plays a fundamental role and Caveolin-1 is known to promote recycling of membrane components and the activation of GTPases at the leading edge. A key membrane-associated protein involved in such processes is Rab5, a small Rho GTPase that acts as a master regulator of early endocytosis. Recently, evidence has been provided suggesting that p85α, the regulatory subunit of PI3K, is a Rab5 GAP that controls Rab5 inactivation. Structurally, p85α has two SH2 domains, involved in binding to tyrosine-phosphorylated proteins, often including receptors and adaptor proteins. Caveolin-1, on the other hand, is known to promote the migratory and invasive capacity of tumor cells via phosphorylation on tyrosine-14. Furthermore, Rab5 activates Rac-1 and promotes lamellipodia formation, through recruitment of the GEF Tiam1. Together, these events lead to changes that permit cell migration. However, the precise mechanisms by which Caveolin-1 participates in the regulation of such processes and specifically whether Caveolin-1 enhanced migration and invasion in vitro involves a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis remained to be determined. Also, a model of B16F10 murine melanoma metastasis in syngeneic C57BL / 6 mice was employed to evaluate the relevance of Rab5, p85α and Rac-1 in promoting Caveolin-1-enhanced lung metastasis in vivo. The results obtained during this thesis demonstrate that Caveolin-1 promoted migration, invasion and activation of Rab5 in the metastatic cell lines HT-29 (US), B16-F10 and MDA-MB-231. Moreover, the expression of Caveolin-1 was shown to increase the average size of early endosomes in B16F10 cells, consistent with a role in the activation of Rab5. To study molecular mechanisms that explain these results, the expression of p85α was shown to decrease Rab5 activation induced by Caveolin-1. Using inhibitors, the activation of Rab5 by Caveolin-1 was shown to be independent of PI3K activity. Moreover, expression of Rab5 was required for Caveolin-1 to promote cell migration and invasion. Importantly, the activation of the small GTPase Rac-1 induced by Caveolin-1 required the presence of Rab5 to promote migration. Furthermore, evidence is provided showing that recruitment of the Rac1 GEF Tiam1 to early endosomes was enhanced in the Caveolin-1 positive cells. Finally, using short-hairpin knock-down technology Rab5, p85α and Rac-1 were shown to be required for Caveolin-1 to promote migration and invasion in vitro, as well as metastasis in vivo in C57BL / 6 mice. In conclusion, the results of this thesis shed light on the molecular mechanisms involved in Caveolin-1-enhanced migration, invasion and metastasis and propose the existence of a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis downstream of Caveolin-1 that contributes to deregulation in cáncer and potentially represents an interesting target for treatments in cancer patients