Dinámica de la resistencia a Trimetoprim en cepas de Shigella sonnei aisladas en Chile entre los años 1995-2013

Abstract

La shigelosis es una infección intestinal aguda causada por bacterias del género Shigella, cuyos síntomas varían desde diarrea acuosa hasta disentería bacilar inflamatoria grave. Shigella es un patógeno cuyo único hospedero es el humano, presenta una muy baja dosis infectiva (solo 10 organismos viables pueden producir enfermedad) y se contagia principalmente por vía fecal-oral. Esta bacteria permanece dentro de las cuatro principales causas de diarrea moderada-grave en niños menores de 5 años en países en vías de desarrollo, predominando el serogrupo S. flexneri, a diferencia de nuestro país donde predomina el serogrupo S. sonnei. Con el transcurso del tiempo, Shigella ha sido capaz de adquirir rápidamente diversos mecanismos de resistencia a los antibióticos utilizados en su tratamiento, lo que genera la necesidad de conocer el patrón de susceptibilidad que presenta este patógeno antes de comenzar la terapia. Uno de los antibióticos utilizados en su tratamiento es el trimetoprim (Tmp), el cual inhibe la actividad de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). La resistencia a este antibiótico se genera principalmente por la adquisición de genes dfr que codifican para una enzima DHFR resistente a Tmp. En nuestro país, la resistencia a Tmp en cepas de S. sonnei aisladas entre los años 1995 y 1997 se atribuye principalmente a la presencia de los genes dfrA1 y dfrA8, pero en un brote de S. sonnei surgido en los años 2008 y 2009, esta resistencia se debe a otro mecanismo no identificado. Además, la mayoría de las cepas de S. sonnei aisladas después del brote, presentan resistencia a Tmp pero su mecanismo de resistencia no ha sido estudiado. Debido a esto, en el presente trabajo se propuso determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim y evaluar su distribución en cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país entre los años 1995 y 2013. Este mecanismo de resistencia se identificó mediante el uso de una genoteca construida con el ADN de una cepa de S. sonnei resistente a Tmp, revelando mediante secuenciación, un cassette genético que incluye al gen dfrA14 como responsable de la resistencia a este antibiótico. Posteriormente, se determinó la distribución del gen dfrA14 y de los genes previamente descritos dfrA1 y dfrA8 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las cepas aisladas entre los años 1995 y 2013. De esta forma, se obtuvo que entre los años 1995-1997 y 2004- 2006 predominó dfrA8, en tanto que el 100% de las cepas aisladas durante el brote 2008-2009 presentaron dfrA14. Posteriormente, en los años 2010-2011 se detectó la presencia de dfrA1 y dfrA14 en proporciones similares y luego en el 2012-2013 reapareció además dfrA8. Adicionalmente, se determinó que la totalidad de las cepas que presentan dfrA14, lo hacen en el contexto genético de un plásmido de 6779 pb, capaz de otorgar resistencia a cotrimoxazol (mezcla de Tmp y sulfonamidas), denominado pABC-3. Este plásmido es prácticamente idéntico a un plásmido de E. coli denominado pCERC1, salvo por la ausencia de una repetición de 11 pb en su secuencia. También es similar a otros plásmidos presentes en Shigella, cuya principal diferencia es la ausencia de dfrA14. Esto sugiere dos posibles orígenes del pABC-3: uno es la adquisición del plásmido desde una E. coli y el otro es la inserción del cassette que contiene dfrA14 en los plásmidos presentes en Shigella. En conclusión, en el presente trabajo se describe que la resistencia a Tmp en cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país se debe mayoritariamente a la presencia de los genes dfrA1, dfrA8 y dfrA14 y que este último se encuentra en el contexto genético del plásmido pABC-3, confiriendo resistencia a Tmp a la mayoría de las cepas de S. sonnei aisladas en nuestro país desde el año 2004 hasta 2013

Shigellosis is an acute intestinal infection caused by bacterial genus Shigella. Its symptoms vary from watery diarrhea to severe inflammatory bacillary dysentery. Shigella, a strictly human-pathogen, has a very low infectious dose (10 bacterial cells can produce illness) and is transmitted via faecal-oral. This pathogen affects mainly children under 5 years in developing countries, where S. flexneri is the most important serogroup, while in Chile S. sonnei is the prevalent serogroup. The use of antibiotics against Shigella is the first line therapy, however lately the acquisition of resistance mechanisms has increased. Therefore, antimicrobial susceptibility profiles are required before starting any treatment. Trimethoprim (Tmp), one of selected antibiotics against this pathogen, inhibits the activity of the dihydrofolate reductase enzyme (DHFR). Tmpresistant (TmpR) bacteria are mainly due to acquisition of dfr genes, coding for DHFR enzymes. S. sonnei strains isolated in Chile between 1995 and 1997 showed the presence of dfrA1 and dfrA8 genes, but the mechanism of Tmp-resistance in a later outbreak (2008-2009) is unknown. The majority of S. sonnei strains isolated after the outbreak are TmpR, but their resistance mechanism has not been studied yet. The general aim of this study was to identify the genetic marker responsible of the Tmp resistance mechanism in S. sonnei strains isolated between 1995 and 2013. A DNA library was obtained from a representative TmpR S. sonnei strain from the outbreak and a recombinant E. coli TmpR was isolated. Further, the sequenced clone was identified as harbouring the dfrA14 gene. We evaluated the distribution of the dfrA14 gene and the previously described genes, dfrA1 and dfrA8 in a laboratory collection of S. sonnei from 1995 – 2013. The results show that within periods 1995- 1997 and 2004-2006 the dfrA8 gene was the most prevalent, while 100% of the isolated strains during the 2008-2009 outbreak present the dfrA14 gene. Later, between 2010 and 2011 dfrA1 and dfrA14 were detected in similar proportions, and then, between 2012 and 2013 dfrA8 reappeared. In addition, it was determined that the dfrA14 gene is harboured in a 6779 bp plasmid, named pABC-3, which confers cotrimoxazole resistance. This plasmid is nearly identical to the pCERC1 plasmid isolated from E. coli, except for an 11 bp sequence missing in pABC-3, and similar to other Shigella plasmids, without the insertion of the dfrA14 gene cassette. This suggests two possible origins for the pABC-3 plasmid. One of them is the acquisition of the whole plasmid from E. coli and the other is the insertion of the dfrA14 gene cassette into a Shigella dfrA14 -less plasmid. In conclusion, the present study showed that Tmp resistance in S. sonnei strains isolated in Chile is mainly due to the presence of the dfrA1, dfrA8 and dfrA14 genes. This last gene is found inside the pABC-3 plasmid conferring Tmp resistance to the majority of S. sonnei strains isolated between years 2004 and 2013 in our country