Estudio del rol de la celobiohidrolasa del hongo Phanerochaete chrysosporium en la sacarificación de residuos forestales de Nothofagus pumilio

Abstract

En la actualidad el uso de combustibles alternativos al petróleo ha tomado auge por el agotamiento de los combustibles fósiles y por el daño al medio ambiente que éstos provocan. Por esta razón la búsqueda de nuevos combustibles ha adquirido gran relevancia. La producción de etanol a partir de biomasa, conocido como bioetanol, surgió como una posible solución al problema de los combustibles; sin embargo, la materia prima para su producción proviene de cultivos de origen alimenticio, utilizando para esto grandes zonas de cultivo, lo que genera una gran controversia. Debido a esto surgió el bioetanol de segunda generación, que utiliza para su producción biomasa lignocelulósica. Esta biomasa se encuentra en grandes cantidades, principalmente como desechos de la industria del papel y de residuos agrícolas. Para la producción de bioetanol desde material lignocelulósico, son necesarias dos etapas adicionales en comparación con la producción de bioetanol de primera generación: una etapa de pretratamiento del material lignocelulósico, y una etapa de hidrólisis de la celulosa. Para la segunda etapa se utilizan celulasas, enzimas que hidrolizan la celulosa para la generación de azúcares simples. El problema es el alto costo de producción asociado a la utilización de estas enzimas. Las investigaciones se han enfocado en el mejoramiento de las celulasas para optimizar el proceso de la hidrólisis de celulosa, con el fin de disminuir los costos de producción del bioetanol de origen lignocelulósico. En la etapa de hidrólisis de la celulosa actúan tres celulasas en forma sinérgica: endoglucanasas, celobiohidrolasas y ß-glucosidasas. Phanerochaete chrysosporium es un hongo que produce varias celulasas, entre ellas el complejo enzimático CBH-I constituido por varias celobiohidrolasas, que constituye el 12% de proteínas totales secretadas por este hongo. El objetivo general de este trabajo es estudiar el rol de CBH-I del hongo P. chysosporium en el proceso de hidrólisis del material lignocelulósico de Nothofagus pumilio (lenga), utilizando una fracción altamente enriquecida con CBH-I proveniente de P. chrysosporium y distintas concentraciones de una endoglucanasa comercial de T. viride, con el fin de obtener un mejor rendimiento de sacarificación que el preparado comercial de T. reesei. Se eligió lenga por ser la segunda especie nativa más abundante en Chile y que presenta residuos abundantes, cuya biomasa puede ser ocupada para la producción de bioetanol de segunda generación Se comparó la sacarificación de lenga por el tratamiento con extractos enzimáticos provenientes del hongo P. chrysosporium versus un preparado comercial de T. reesei. Al comparar la sacarificación, no se observaron grandes diferencias, solo se observó un aumento significativo en la sacarificación por T. reesei a las 48 horas de incubación con 40 μg de proteínas por mg de sustrato. Para determinar si era factible mejorar el proceso de sacarificación del material lignocelulósico, que utiliza enzimas comerciales del organismo T. reesei y estudiar el rol de CBH-I en la sacarificación, se aisló y purificó CBH-I desde un cultivo P. chrysosporium y se realizaron experimentos de comparación de la sacarificación entre CBH-I con una endoglucanasa de T. viride versus el preparado comercial de T. reesei, además se estudió la acción conjunta entre CBH-I y la endoglucanasa comercial T. viride. CBH-I en combinación con una endoglucanasa de T. viride produce una sacarificación mayor que el preparado comercial de T. reesei a las 72 horas de incubación. Se observó sinergismo a concentraciones menores de celulasas (20 μg/ml), encontrándose una disminución de la cooperación a concentraciones mayores (100 μg/ml). Se concluye que CBH-I proveniente de P. chrysosporium podría ser una alternativa para preparaciones enzimáticas comerciales para la degradación de lignocelulosa Además, con el fin de producir celobiohidrolasas CBH-I en mayor cantidad, se realizaron experimentos de expresión de proteínas recombinantes en el organismo E. coli Rosetta-gamiTMB. Para esto se ocuparon dos secuencias génicas de CBH-I aisladas desde el hongo P. chrysosporium denominadas CBH-I cel 7-1 y CBH-I cel 7-2. El uso del sistema de E. coli Rosetta-gami™B, permitió producir CBH-I cel 7-1, aunque en forma inactiva. No se produjo CBH-I cel 7-2 recombinante