Evaluación de la capacidad de hemocianinas de moluscos para activar la vía clásica del sistema del complemento humano

Abstract

Las hemocianinas son metaloglicoproteínas de elevado tamaño presentes en la hemolinfa de algunos moluscos, cuya función principal es el transporte de oxígeno. La hemocianina más estudiada se obtiene de la Lapa Californiana, Megathura crenulata y se conoce como KLH, presentando notorias capacidades inmunomoduladoras, por lo que ha sido utilizada con múltiples fines terapéuticos y de investigación. Sin embargo, las recientemente descubiertas hemocianinas del Loco, Concholepas concholepas, (CCH) y de la Lapa Negra, Fissurella latimarginata, (FLH), han cobrado relevancia, dadas sus mejores propiedades en cuanto a estabilidad y efectos inmunoestimulantes, respectivamente. No obstante, los mecanismos inmunológicos mediante los cuales estas proteínas ejercen sus diversas acciones son poco conocidos. Así, un factor frecuentemente mencionado es su alto contenido de carbohidratos (hasta 9% en peso), con diferencias en su composición entre las especies mencionadas. Interesantemente, se ha descrito en individuos no inmunizados de varias especies, incluyendo los seres humanos, la presencia de anticuerpos naturales reactivos con KLH que estarían dirigidos contra sus carbohidratos, hecho que lleva a considerar como otro factor posible al sistema del complemento. El sistema del complemento es un conjunto de proteínas plasmáticas y de membrana cuya activación, finamente regulada se lleva a cabo en una secuencia de eventos proteolíticos limitados sobre los componentes iniciales. Culmina con la lisis del patógeno mediante la formación de complejos de ataque de membrana. Además, conduce a la opsonización del patógeno y a la coestimulación de linfocitos B, junto con la producción de anafilotoxinas con propiedades inflamatorias, que favorecen la respuesta inmune. Este sistema puede ser activado por la vía clásica, mediante anticuerpos que reconocen al agresor; la vía de las lectinas, mediante diversos carbohidratos presentes en el células agresoras, y la vía alterna, en que el sistema detecta ausencia de moléculas “propias”. En vista de estos antecedentes, proponemos que la presencia, en individuos no inmunizados, de anticuerpos naturales que reconocen a las hemocianinas, conduce a la activación de la vía clásica del sistema del complemento humano por dichas proteínas. Así, el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar un rol del complemento que contribuya a explicar la capacidad inmunoestimulante no específica de las hemocianinas en mamíferos. En primera instancia, se analizaron los sueros de 4 pacientes inmunizados con KLH, identificándose dos pacientes con altos niveles de anticuerpos anti-KLH, los cuales se utilizaron como controles positivos para la detección de anticuerpos en donantes no inmunizados con hemocianinas. Así, se detectó en una muestra de 5 donantes, diferentes niveles de anticuerpos no sólo contra KLH, sino que también contra FLH y CCH. Luego, para analizar la especificidad de estos anticuerpos, se realizó una desglicosilación química de las hemocianinas y se observó si esto afectaba la unión de estos anticuerpos, encontrándose que este tratamiento afectó de forma diferencial su reactividad. Específicamente, en algunos casos la desglicosilación disminuyó la unión de los anticuerpos, en otros casos no tuvo efecto y en otros incluso aumentó. Posteriormente, se procedió a analizar la capacidad de algunos sueros para activar la vía clásica del sistema del complemento in vitro, fenómeno que ocurrió con todas las hemocianinas, aunque no se pudo establecer una correlación entre el nivel de anticuerpos y la intensidad de la activación. Además, en concordancia con lo observado anteriormente, la desglicosilación de las hemocianinas tuvo un efecto diferencial en la activación de esta vía, destacándose el efecto sobre FLH, en la cual la desglicosilación aumentó fuertemente tanto la unión de anticuerpos como la activación de la vía clásica. En concordancia con estos resultados, cuando se utilizó un anticuerpo anti-C1q que inhibe específicamente la activación de la vía clásica, esta activación fue revertida. En conjunto, estos resultados apuntan a un nuevo rol para el sistema del complemento, específicamente a través de la vía clásica, con respecto a las notables propiedades inmunomoduladoras no específicas de las hemocianinas de moluscos en mamíferos. Si bien no se pudo definir un rol preponderante para los carbohidratos en todas las hemocianinas, los resultados señalan la necesidad de continuar con esta línea de investigación, para proveer información adicional para un uso seguro de las hemocianinas en biomedicina

Hemocyanins are metalloglycoproteins with large molecular sizes present in the hemolymph of some mollusks, with oxygen transport being their main function. The most studied hemocyanin is obtained from the keyhole limpet, Megathura crenulata and it is known as KLH, with remarkable immunomodulatory capacities, leading to its use in multiple therapeutical and research approaches uses. However, the recently discovered hemocyanins of the Chilean abalone, or “Loco”, Concholepas concholepas (CCH), and that from “Lapa negra”, Fissurella latimarginata, (FLH), have become relevant, given their better properties regarding stability and immunomodulatory effects, respectively. In spite of this, the mechanisms through which these molecules exert their effects are scarcely understood. A frequent explanation is their high carbohydrate content (up to 9% w/w), with differences between their compositions among the mentioned species. Interestingly, in unimmunized individuals from different species, humans included, it has been described the presence of natural antibodies reactive with KLH, possibly through its carbohydrate moieties, leading to the possibility that the complement system is also involved. The complement system is a group of plasma and membrane-bound proteins whose finely regulated activation is carried out in a sequence of limited proteolytic events, involving mainly the initial components. It culminates with the pathogen lysis through formation of membrane attack complexes. It also leads to pathogen opsonization and B cell costimulation, along with the production of anaphylatoxins with inflammatory properties, thus favoring the immune response. This system can be activated through the classical pathway, due to antibodies recognizing an aggressor; the lectin pathway, due to diverse carbohydrates present on the aggressor cells; and the alternate pathway, where the system detects the absence of “self” molecules. Taking these antecedents into account, we propose that the presence, in unimmunized individuals, of antibodies recognizing the hemocyanins, leads to the activation of the classical pathway of the human complement system by these proteins. Thus, the general goal of this thesis has been to study a role of the complement that contributes to explain the non-specific immunostimulatory capacity of the hemocyanins in mammals. First, the sera of 4 patients immunized with KLH were analyzed, and two patients with a high level of anti-KLH antibodies were identified, being used as a positive controls for the detection of antibodies in healthy donors previously unimmunized with hemocyanins. Then we detected in 5 donors, different levels of antibodies not only against KLH, but also against FLH and CCH. In order to analyze the specificity of these antibodies, the hemocyanins were chemically deglycosylated and we observed how this affected the antibody binding in the sera of unimmunized donors, concluding that this treatment affected differentially their reactivity, Specifically, deglycosylation in some cases diminished antibody binding, while in others, no effect was observed and yet, in some it was even increased. Then, the ability of some sera to activate in vitro the classical pathway of the complement system was assessed, a phenomenon that was observed with all hemocyanins, although no correlation between antibody level and activation intensity could be established. Also, as observed before, hemocyanin deglycosylation had a differential effect in the activation of this pathway, with a remarkable effect over FLH, where deglycosylation strongly increased both antibody binding and classical pathway activation. In agreement with these results, when an anti-C1q antibody that specifically inhibits classical pathway activation was used, this activation was reversed. Taken together, these results point towards a new role for the complement system, specifically through the classical pathway, regarding the remarkable non-specific immunomodulatory properties of the molluskan hemocyanins in mammals. Even though we could not define a prevailing role for carbohydrates in all hemocyanins, the results indicate the need to continue with this line of research, to provide additional information for a safe use of hemocyanins in biomedicine