Aislamiento y caracterización de bacterias antárticas capaces de metabolizar fenantreno en presencia de metales pesados

Abstract

La Antártica es el continente más austral de la tierra, contiene cerca del 80% de las reservas de agua dulce del planeta y presenta una serie de condiciones extremas, como bajas temperaturas y alta radiación ultravioleta. A pesar de esto, el hombre ha sido capaz de sobrevivir en la región y realizar actividades científicas y de explotación durante más de 80 años. Como consecuencia, las distintas zonas habitadas han sufrido contaminación, principalmente asociada a diesel. Este compuesto es nocivo, ya que presenta una gran cantidad de moléculas orgánicas como hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) y compuestos inorgánicos como metales pesados (Cd, Cr y Pb). La descontaminación de HAPs se puede llevar a cabo mediante procesos físicos, químicos y biológicos. Los procesos biológicos representan una opción ecológica, económica y segura, que involucra una menor alteración de los suelos y en consecuencia constituye una excelente alternativa para la descontaminación del territorio Antártico. A la fecha, se ha reportado un gran número de bacterias capaces de degradar HAPs. Sin embargo, debido al Tratado Antártico no está permitido ingresar microorganismos o ADN foráneo al continente, por lo que se hace vital encontrar bacterias nativas que puedan ser usadas en la biorremediación de diesel en Antártica. Debido a su mayor solubilidad en agua, menor toxicidad para el humano y similitud estructural con otros HAPs, el compuesto que se utiliza como modelo para aislar y estudiar microorganismos degradadores de HAPs es el fenantreno. En base a lo expuesto, se planteó la hipótesis: “La presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos y metales pesados en suelos antárticos ha favorecido el desarrollo de bacterias degradadoras de fenantreno resistentes a metales”. El objetivo general de este trabajo fue aislar y caracterizar bacterias antárticas resistentes a metales pesados (Cd, Cr y Pb) y evaluar su capacidad de metabolizar fenantreno. Para esto se utilizó muestras de suelo antártico obtenido de distintas zonas expuestas y no expuestas a diesel, las cuales fueron caracterizadas química y biológicamente. Además, se aisló y caracterizó bacterias degradadoras de fenantreno resistentes a metales y se estudiaron los procesos asociados a la degradación de fenantreno. Durante este trabajo de tesis se utilizó muestras de suelo obtenidas de la 49° Expedición Científica Antártico (ECA 49°): 4 muestras de suelos no expuestos a diesel (A0, B4, C3 y C8) y 4 muestras de suelos expuestos a diesel (D3, D4, E2 y E4). El análisis del suelo determinó la presencia de HAPs en los suelos expuestos a diesel, en promedio 1000 veces más concentrado que en los suelos sin exposición. Además, en los suelos D3 y D4 (suelos expuestos a diesel) se observó una mayor concentración de cadmio y plomo total en comparación a todas las muestras, sobre los 30 y 600 mg Kg-1, respectivamente. Respecto a la caracterización biológica, el suelo expuesto a diesel D4 presentó mayor actividad biológica y número de heterótrofos, relacionado directamente al contenido de HAP (el suelo D4 presentó la mayor concentración del hidrocarburo, ̴ 30 mg Kg-1). De los 8 suelos se aisló 350 microorganismos, de los cuales 53 fueron capaces de degradar fenantreno. Mediante un screening desarrollado durante esta tesis basado en espectroscopía de fluorescencia total asociada a calibración multivariada, se seleccionó 3 aislados por su alto nivel de degradación. Estos microorganismos se caracterizaron, en particular la cepa D43FB (identificada como Pseudomonas flavescens) resiste 25 mg L-1 de Cd+2 y 5 mg L-1 de Cr+6. Además, tras 7 de incubación es capaz de degradar hasta un 80% de fenantreno en medio M9 con el hidrocarburo como única fuente de carbono. Al agregar 0.025, 0.05 y 0.5 mg L-1 de Cd+2 el porcentaje de degradación es 60, 26 y 25 mg L-1, respectivamente. Además, en un proceso de bioaumetación de suelos degrada aproximadamente un 75% de los hidrocarburos presentes en el terrario. Por otro lado, a este aislado se asoció su capacidad de degradar fenantreno a la facultad de formar biopelículas y adherirse a cristales de este compuesto, junto con descartar la liberación de biosurfactante o la quimiotaxis. Siendo una excelente alternativa para más ensayos de biorremediación de suelos. El trabajo planteado tiene profundas implicaciones para estudios en biorremediación y potencialmente podría representar una alternativa de descontaminación de ecosistemas antárticos aprovechando los bio recursos propios de la Antártica. La proyección de este trabajo está asociada a dilucidar completamente los procesos asociados a la degradación de Pseudomonas flavescens D43FB y continuar ensayos de biorremediación en terrarios, y así eventualmente terminar la investigación en un proceso in situ en Antártica

Antarctica is the southernmost continent on earth, contains ~80% of the planet's fresh water and presents a series of extreme conditions such as low temperatures and high ultraviolet radiation. Despite this, the man has been able to survive in the region doing scientific and operational activities for over 80 years. Consequently, various inhabited areas have been contaminated mainly with diesel. This compound is harmful, because it is composed by organic molecules such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and heavy metals (Cd, Cr and Pb). Decontamination of PAHs can be accomplished by physical, chemical and biological processes. Biological processes represent an ecological, economical and safe option that involves a minor alteration of the soil and thus is an excellent alternative for the decontamination of the Antarctic territory. To date, a large number of bacteria capable of degrading PAHs has been reported, however due to the Antarctic treaty is prohibited to enter foreign DNA and microorganisms to the mainland, so it is vital to find native bacteria that can be used in diesel bioremediation. Due to its higher solubility in water, lower toxicity to humans and structural similarities to other PAHs, the compound used as a model to isolate and study PAH degraders is phenanthrene. Based on the above, in this thesis the following hypothesis was proposed: "The presence of polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in Antarctic soils has favored the development of phenanthrene degrading bacteria resistant to heavy metals". The overall objective of this work was to isolate and characterize Antarctic bacteria resistant to heavy metals (Cd, Cr and Pb) and assess their ability to metabolize phenanthrene. To accomplish this, Antarctic soils obtained from different areas exposed to diesel were characterized chemically and biologically. Also, phenanthrene degrading bacteria resistant to heavy metals were isolated and characterized, and the degradation mechanisms involved were studied. Soil samples were obtained during the 49th expedition to the Antarctic continent (ECA 49), 4 soils none exposed to diesel (A0, B4, C3 and C8) and 4 soils exposed to diesel (D3, D4, E2 and E4). Soil analysis determined the presence of tri-aromatic polycyclic hydrocarbons in soil exposed to diesel, on average 1000 times more concentrated than in soils with no exposure. Moreover, D3 and D4 soils (exposed to diesel) display a greater cadmium concentration and total lead when compared to all samples, ~30 and 600 mg Kg-1, respectively. Regarding the biological characterization, soil exposed to diesel D4, display greater biological activity and heterotrophes, a result that was directly related to PAH content (D4 soil display the highest concentration of hydrocarbons, ~30 mg Kg-1). This relationship was confirmed by a soil enrichment test with phenanthrene, where it was observed that phenanthrene acts as a supplement in soils exposed to diesel. 350 environmental microorganisms were isolated from the 8 Antarctic soils, 53 of them were able to degrade phenanthrene. Three of them were selected for their high capacity to degrade the hydrocarbon. These isolates were selected through a screening developed during this thesis, based on total fluorescence spectroscopy associated to second order multivariate calibration. Selected isolates were characterized and the resistance to heavy metals was determined. In particular, strain D43FB (corresponding to Pseudomonas flavescens) resists 25 mg L-1 of Cd+2 and 5 mg L-1 of Cr+6. After 7 days, this bacterium was able to degrade ~80% of phenanthrene in M9 medium with the hydrocarbon as a sole carbon source. By adding 0.025, 0.05 and 0.5 mg L-1 of Cd+2 this value decreases to 60, 26 and 25 mg L-1, respectively. Moreover, in a bioaugmentation assay of soil the isolate is capable of degrading ̴75 % of PAH present in the terrarium. In the other hand, the capacity of this microorganism to degrade phenanthrene was associated with their ability to form biofilm and adhere to phenanthrene crystals. The proposed work has profound implications for bioremediation studies and potentially could represent an alternative for the decontamination of Antarctic ecosystems. The projection of this work is linked to fully elucidate the mechanism of degradation of Pseudomonas flavescens D43FB and continue testing bioremediation in terrariums, and so eventually complete the investigation with an in situ process in Antarctica