Participación de la autofagia en la inducción del fenotipo sintético por TNF-[alfa] en células musculares lisas vasculares

Abstract

Antecedentes y objetivo: La aterosclerosis se caracteriza por una desdiferenciación las células de músculo liso vascular (VSMC) a un fenotipo migratorio, proliferativo, con baja expresión de proteínas de contracción y una elevada síntesis de matriz extracelular. Esta enfermedad cardiovascular tiene un componente inflamatorio crónico con presencia del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) en el tejido aterosclerótico. Además, se ha observado que las VSMC de placas de ateroma tienen inducida la autofagia, un mecanismo asociado con la degradación de proteínas y organelos intracelulares. El objetivo de este estudio fue evaluar si el TNF-α induce desdiferenciación en las VSMCs, transformándolas a un fenotipo proinflamatorio con mayor capacidad de migración y proliferación, y si este cambio de fenotipo es mediado por autofagia. Metodología: El modelo de estudio es la línea celular de VSMCs de aorta de rata A7r5. El estímulo de TNF-α fue de 100 ng/mL. La autofagia se determinó midiendo los niveles proteicos de LC3-II, p62 y formación de vacuolas autofágicas marcándolas con LC3-GFP. La participación de la autofagia se evaluó inhibiéndola farmacológicamente con cloroquina, y genéticamente con siRNA de Beclin1. La desdiferenciación celular se evaluó midiendo la expresión y organización de las proteínas de contracción α-SMA y SM22, los niveles de las proteínas de matriz extracelular colágeno tipo I y osteopontina, proliferación celular por incorporación de [3H]-timidina y ensayo de MTT, y migración por ensayo de herida y de transwell usando una cámara Boyden. Los parámetros inflamatorios se evaluaron mediante la medición de las proteínas IL-1β, IL-6 e IL-10 por ELISA. Resultados: El TNF-α indujo autofagia reflejado por un aumento de LC3-II (1,91±0,21 veces vs control, p<0,01) y una disminución de p62 (0,77±0,05 veces vs control, p<0,001). Esta autofagia fue dependiente de IKK ya que el aumento de LC3-II inducida por TNF-α se inhibió con BAY-117082. Además, TNF-α indujo migración celular (1,45±0,09 veces vs control, p<0,01), proliferación (2,33±0,24 veces vs control, p<0,05), secreción de IL-6 (258±53 veces vs control, p<0,01), aumento de las proteínas de matriz extracelular colágeno tipo I (3,09±0,85 veces vs control, p<0,01) y osteopontina (2,32±0,46 veces vs control, p<0,01) y disminución de las proteínas contráctiles α-SMA (0,74±0,12 veces vs control, p<0,05) y SM22 (0,54±0,01 veces vs control, p<0,05). Además, el factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), un inductor clásico de desdiferenciación de VSMC, al igual que el TNF-α, también indujo un aumento de la secreción de IL-6 en las VSMC. Cuando se inhibió la autofagia farmacológica o genéticamente, estos cambios fenotípicos inducidos por TNF-α no ocurrieron. Conclusión: En este trabajo se demostró que el TNF-α induce desdiferenciación celular, proliferación y migración en VSMCs de forma dependiente de autofagia. Además, el TNF-α también aumentó la secreción de IL-6, efecto que fue también dependiente de autofagia. Debido a que el fenotipo proinflamatorio también se indujo con PDGF-BB, sugerimos que el fenotipo proinflamatorio podría ser una característica común de las VSMC desdiferenciadas. Palabras claves: VSMC, TNF-α, autofagia, desdiferenciación, migración, proliferación y citoquinas

Background and aim: Atherosclerosis is characterized by vascular smooth muscle cells (VSMC) dedifferentiation to a proliferative and migratory phenotype with low contractile protein expression and high extracellular matrix synthesis. This cardiovascular disease has a chronic inflammatory component with the presence of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the atherosclerotic tissue. Furthermore, it has been observed that VSMC of atheromatous plaques have increased autophagy, a mechanism associated with protein and intracellular organelles degradation. The aim of this study was to evaluate if TNF-α induces VSMC dedifferentiation, triggering a proinflammatory phenotype with higher migration and proliferation capacity, and if this phenotype switching is mediated by autophagy. Methodology: Studies were performed in a rat aortic VSMC cell line A7r5. Cells were stimulated with TNF-α 100 ng/mL. Autophagy was determined by measuring LC3-II and p62 protein levels and autophagic vesicles formation using LC3-GFP. Autophagy was pharmacologically inhibited with chloroquine, and genetically with a siRNA Beclin1. Cell dedifferentiation was evaluated by measuring the expression and organization of contractile proteins α-SMA and SM22, extracellular matrix protein osteopontin and type I collagen levels. Cell proliferation was measured by [3H]-thymidine and MTT assay, and migration was evaluated by wound assay and transwell using a Boyden chamber. Inflammatory parameters were measured by the expression of IL-1β, IL16 and IL-10 proteins by ELISA. Results: TNF-α induced autophagy as determined by LC3-II level increase (1.91±0.21 fold vs control, p<0.01) and p62 level decrease (0.77±0.05 fold vs control, p<0.001). This autophagy was dependent on IKK because TNF-α-dependent LC3-II increase was inhibited by BAY-117082. In addition, TNF-α induced migration (1.45±0.09 fold vs control, p<0.01), proliferation (2.33±0.24 fold vs control, p<0.05), IL-6 secretion (258±53 fold vs control, p<0.01), extracellular matrix proteins collagen type I (3.09±0.85 fold vs control, p<0.01) and osteopontin (2.32±0.46 fold vs control, p<0.05), and decreased contractile proteins α -SMA (0.74±0.12 fold vs control, p<0.05) and SM22 (0.54±0.01 fold vs control, p<0.05). In addition, platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), a classic VSMC dedifferentiation inducer, as well as TNF-α, also induced an increase in IL-6 secretion in those cells. When autophagy was pharmacologically or genetically inhibited, these TNF-α-induced phenotypic changes did not occur. Conclusion: In this study it was shown that TNF-α induces cell dedifferentiation, proliferation and migration in VSMCs in an autophagy dependent manner. In addition, TNF-α also increases IL-6 secretion, this effect is also dependent of autophagy. Because the proinflammatory phenotype is also induced with PDGF-BB, we suggest that the proinflammatory phenotype could be a common feature of dedifferentiated VSMCs