Aumento en la expresión de DSCAM y su acción sobre parámetros morfológicos neuronales a través de efectores de la vía PAK en un modelo celular del Síndrome de Down

Abstract

El Síndrome de Down se define como un desorden del desarrollo causado por la presencia de una copia extra del cromosoma 21, que va acompañado de anomalías multisistémicas principalmente a nivel del sistema nervioso central, generando una discapacidad cognitiva. Se ha descrito que el gen dscam, que codifica para la Molécula de Adhesión Celular del Síndrome de Down (DSCAM), presente en el cromosoma extra, actúa como una molécula de adhesión en el establecimiento y maduración de sinapsis y formación de nuevas redes neuronales a través de quinasas relacionadas directamente en procesos fisiológicos neuronales denominadas PAKs. Estas juegan un rol central en los mecanismos de señalización celular mediante LIMK1, la cual a su vez regula a Cofilina que reordenan el citoesqueleto en particular los filamentos de actina. En esta tesis se trabajó con líneas neuronales trisómicas de corteza cerebral de fetos de ratones Ts16, llamada CTb, y líneas control derivadas de un ratón normal de la misma camada llamada CNh, donde se desconocía la relación DSCAM-PAK sobre parámetros morfológicos neuronales. En este trabajo hipotetizamos que el aumento en la expresión de la proteína DSCAM en la línea celular CTb, en comparación con la línea normal CNh, produce una hiperactivación de PAK y sus efectores río abajo en la vía de señalización, lo que se traduce en una disminución del número y longitud de neuritas. El objetivo general fue determinar los niveles de expresión del gen dscam y su acción sobre la activación de PAK, analizando parámetros morfológicos en la línea neuronal CTb, utilizando como control a la línea CNh. Los objetivos específicos fueron: 1) Cuantificar los niveles de expresión de DSCAM. 2) Estudiar parámetros morfológicos, número y longitud de neuritas. 3) Determinar el nivel de expresión de las proteínas PAK y su estado de activación. 4) Determinar la activación de blancos moleculares río abajo de la vía PAK como LIMK1 y Cofilina. Se encontró en la línea CTb: 1) Un aumento en la expresión de DSCAM en comparación a la línea CNh, en condiciones basales de proliferación y diferenciación celular. 2) Menor complejidad neuronal, en cuanto al número y largo de sus neuritas en comparación a la línea normal. El knockdown para DSCAM en la línea CTb revirtió de manera parcial el fenotipo normal observado en CNh. 3) Las quinasas PAK se expresan de manera similar en ambas líneas celulares, con una mayor activación temporal de PAK1 en la línea CTb con respecto a CNh, tras activar DSCAM a través de su ligando específico, Netrina. La reducción de los niveles de DSCAM en la línea CTb a niveles comparables a aquellos de CNh, revierten la mayor activación de PAK1 inducida por Netrina. 4) Al igual que la activación temporal de LIMK1 y Cofilina. En conclusión, en esta tesis se demuestra que DSCAM se encuentra sobrexpresado en la condición trisómica, lo que lleva a una mayor sensibilidad de efectores transduccionales de la vía PAK, traduciéndose finalmente en una menor capacidad de extensión de procesos. Por lo tanto, en este trabajo identificamos un circuito regulador clave dentro de la patología del Síndrome de Down, donde PAK juega un rol relevante como potencial blanco terapéutico específico

Down syndrome is defined as a developmental disorder caused by the presence of an extra copy of chromosome 21, which is accompanied by multisystem anomalies mainly in the central nervous system, which translates into a feature cognitive impairment. A gene that has many implications for development is dscam, which encodes for the Down Syndrome Cell Adhesion Molecule (DSCAM), which is present in the triplicated chromosome and acts as an adhesion molecule in the establishment and maturation of synapses, formation of new neural networks through kinases called p21-activated kinases (PAKs). PAKs play a central role in cell signaling mechanisms by LIMK1, which in turn regulates Cofilin, that reorganizes the cytoskeleton in particular by governing actin filament dynamics. In this thesis, we worked with trisomic neural lines from cerebral cortex of fetal Ts16 mice, called CTb, and control lines derived from the same tissue of a euploid littermate called CNh, where DSCAMPAK relationship on neural morphological parameters was unknown. In this work we hypothesized that the increased expression of DSCAM protein in the cell line CTb, compared to that of the normal line CNh, produces a hyperactivation of PAK and its effectors downstream in the signaling pathway, resulting in a decreased number and length of neurites. The overall objective was focused on determining the expression levels of dscam gene and its effect on the activation of PAK, in terms of morphological parameters regulating the latter, in neuronal line CTb using as controls CNh line. The specific objectives were: 1) Quantification of DSCAM expression levels. 2) Study of morphological parameters, number and length of neurites. 3) Determination of the expression levels PAK proteins and their activation state; and 4) to determine the activation of downstream molecular targets of the PAK pathway, LIMK1 and Cofilin. We found in line CTb: 1) An increase in the expression of DSCAM, compared to the CNh line at both basal proliferation and differentiation conditions. 2) Exhibits lower neuronal complexity by Sholl analysis, expressed in a reduced number as well as length of their neurites compared to the normal line. DSCAM knockdown, partially reversed to the normal phenotype observed in CNh cells. 3) PAK kinases were expressed similarly in both cell lines, but there is a greater temporal PAK1 activation in CTb line compared to on CNh cells, in response to DSCAM activation by its specific ligand Netrin. Upon knockdown-induced reduction of DSCAM levels in the CTb to levels comparable to those of CNh cells, the Netrin-induced activity of PAK1 is reduced to levels similar to those of CNh. 4) Similarly to the temporal activation way of LIMK1 and Cofilin. In conclusion, this thesis shows that DSCAM is overexpressed in the trisomic condition, which in turn leads to an increased translational activation of effectors of PAK pathway, finally resulting in a lower capacity to extend processes. Therefore, we have identified a specific key regulator circuit in Down Syndrome pathology, where PAK could play an important role as a potential therapeutic target