Caracterización genética de la morera de papel (Broussonetia papyrifera (L.) Vent.: Moraceae) mediante marcadores de retrotransposones IRAP y REMAP

Abstract

La colonización del Pacífico se gestó en dos grandes procesos de migración: el primero alrededor de 50.000 a 30.000 años antes del presente, y el segundo hace 5.000 a 1.000 años antes del presente. Este último gran movimiento fue complejo y se ha estudiado integrando evidencias arqueológicas, lingüísticas y genéticas con el propósito de dilucidar incógnitas como las diferentes rutas migratorias propuestas sobre el poblamiento de Oceanía. Entre los modelos de estudios genéticos se han analizado muestras humanas, pero éstas presentan diversas complejidades que limitan el alcance de los estudios con este modelo. Por este motivo, surgen los estudios de especies asociadas a los colonizadores polinésicos, de los cuales se han analizado especies animales y vegetales. Entre estos últimos se encuentra la morera de papel (Broussonetia papyrifera), una planta nativa de Asia e introducida a la región de Oceanía Remota. Debido a su uso como fuente de fibra vegetal para textiles y la importancia cultural que representa, resulta interesante abordar su estudio para aportar a la comprensión de las rutas migratorias en Oceanía Remota. La principal herramienta de los estudios genéticos son los marcadores moleculares, que corresponden a regiones de ADN que presentan cierto grado de variabilidad detectable. En B. papyrifera se han analizado regiones de ADN ribosomal y de ADN de cloroplastos, encontrando ausencia de diversidad en muestras de Oceanía Remota. Una alternativa para este tipo de análisis podría ser el uso de marcadores basados en retrotransposones, los cuales han sido descritos como ubicuos en plantas y como fuente de gran diversidad genética. Entre los marcadores basados en retrotransposones se encuentran los Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphisms (IRAP) y Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphisms (REMAP), los cuales amplifican regiones entre secuencias de Repeticiones Terminales Largas (LTR), o entre LTR y secuencias microsatélites, respectivamente. Estos marcadores han sido ampliamente empleados en estudios de diversidad genética debido a su facilidad de uso. En base a los antecedentes presentados, se plantea la siguiente hipótesis: “El estudio de B. papyrifera por medio de marcadores moleculares basados en retrotransposones IRAP y REMAP permite detectar diversidad genética presente en muestras obtenidas de Oceanía Remota que no han sido diferenciadas mediante otros marcadores moleculares”. Con el objetivo de caracterizar la diversidad genética de muestras de B. papyrifera provenientes de Oceanía Remota usando marcadores IRAP y REMAP, se seleccionaron partidores a partir de la literatura para el análisis de muestras de B. papyrifera del hábitat nativo y de la región introducida. En primer lugar, se corroboró que las secuencias amplificadas mediante estos marcadores corresponden a retroelementos, caracterizando cinco secuencias amplificadas con un marcador IRAP. Estas secuencias corresponden a dos posibles tipos de elementos TRIM (Terminal-repeat Retrotransposon In Miniature), los cuales son derivados cortos de retrotransposones que conservan algunas regiones características de retroelementos, pero carecen de marcos de lectura abiertos funcionales. En una etapa siguiente se estandarizaron los protocolos IRAP y REMAP para obtener patrones de amplificación óptimos. Además, se ajustaron las condiciones de electroforesis y de captura de imagen. Inicialmente, se probaron 45 combinaciones de partidores IRAP y 36 combinaciones de partidores REMAP con un grupo de cuatro muestras de prueba de Oceanía Remota. A partir de los resultados obtenidos, se seleccionaron cuatro combinaciones REMAP para analizar 55 muestras representativas del banco genómico de B. papyrifera de distintas localidades del Pacífico. Estos análisis mostraron una baja diversidad genética, apoyando la noción de una dispersión clonal de la morera de papel en las distintas islas del Pacífico. Esta información complementa los resultados obtenidos con otros marcadores utilizados en esta y otras especies, y favorecen modelos migratorios como el “tren rápido” o el de la “Triple I”. Esta memoria de título constituye el primer estudio de retrotransposones en B. papyrifera y abre la posibilidad a nuevos trabajos que profundicen el análisis de la dispersión y la diversificación clonal de la morera de papel en Oceanía Remota, considerando que los retroelementos han sido descritos como fuente importante de diversidad en otras especies vegetales

The human colonization of the Pacific occurred in two major stages: the first migration took place about 50,000 to 30.000 years before present, and the second stage occurred more recently, about 5.000 to 1.000 years before present. This latter large movement was complex and has been widely studied gathering archeological, linguistic and genetic evidence in order to elucidate questions such as the different routes proposed for the settlement of Oceania. Human samples have been analyzed using genetic tools, but these present several complexities that limit their scope. Therefore studies centered on human-associated species (known as commensal species) arise. Animal and plant species have been studied, and among the latter, paper mulberry (Broussonetia papyrifera), a plant native from Asia and introduced in the Remote Oceania Region has been used a commensal model species. Due to its use as a fiber source to make textiles and the cultural importance of paper mulberry, it is interesting to address the study of this species to contribute to the understanding of migratory routes in Remote Oceania. Molecular markers are the main tools to analyze DNA regions that present genetic diversity. In B. papyrifera, ribosomal and chloroplast DNA regions have been analyzed, finding no genetic diversity in samples from Remote Oceania. An alternative to approach this kind of analysis could be the use of retrotransposon-based markers, which have been reported as ubiquitous and a major source of genetic diversity in plants. Retrotransposon-based markers are Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphisms (IRAP) and Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphisms (REMAP), among others. IRAP and REMAP amplify regions between Long Terminal Repeats (LTR), or between LTR and microsatellites, respectively. These markers are easy to apply and have been widely used for genetic diversity studies in different plant species. Based on this background, the following hypothesis is proposed: “The study of B. papyrifera by retrotransposon-based markers IRAP and REMAP allow to detect genetic diversity in samples from Remote Oceania not previously differentiated with others molecular markers”. In order to characterize the genetic diversity of B. papyrifera samples from Remote Oceania by IRAP and REMAP, primers were selected from the literature to analyze samples of B. papyrifera from native and introduced areas. First, we checked that the amplified sequences with these primers were obtained from retroelements. Five sequences amplified with an IRAP marker were characterized and shown to correspond to two types of TRIM (Terminal-repeat Retrotransposon In Miniature) elements, which are short retrotransposon derivatives that have some conserved regions characteristic of retroelements, but lack functional open reading frames. Then, protocols for IRAP and REMAP amplification were standardized in order to obtain optimal amplification patterns. In addition, electrophoresis and image capture conditions were defined. From 45 IRAP and 36 REMAP primer combinations, 4 REMAP combinations showed distinct amplification patterns in a reduced group of B. papyrifera samples from Remote Oceania. The results obtained from the analysis of 55 samples of B. papyrifera using four selected REMAP markers showed little diversity, supporting the notion of a clonal dispersal of paper mulberry among Pacific islands. These results complement data obtained with others markers in paper mulberry and other species, and are consistent with the previously proposed models of human colonization of the Pacific as the “fast train” or the “Triple-I” models. The present work is the first retrotransposon study in B. papyrifera and opens the possibility to further work to analyze the clonal dispersal and diversification of paper mulberry in Remote Oceania, considering that retroelements have been described as an important source of molecular diversity in plant species