Aislamiento, expresión y caracterización de un gen codificante para lipasa a partir de bacterias de orígen marino antártico

Abstract

EI uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial en terminos de menores costos energeticos, aplicaciones terapeuticas y menor contaminacion microbiana en procesos industriales. Las bacterias de origen marino antartico mantienen su metabolismo a muy bajas temperaturas, por 10 que son particularmente deseadas para la identificacion de dichas enzimas. Las lipasas son enzimas lipoliticas de gran utili dad en la industria biotecnologica. Sus aplicaciones involucran a la produccion alimenticia, de detergentes, farmacos enantiomericamente puros, cosmeticos, sintesis de compuestos quimicos, de biopolimeros y agroquimicos, entre otras. Se aislaron bacterias de origen marino antartico, que producen enzimas lipoliticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. Se selecciono la mejor cepa y se realize un analisis del DNAr 16S, que identifico a la cepa como Psychrobacter sp. El DNA genomico de este microorganismo se utilize para realizar una busqueda de un gen de lipasa utilizando partidores disefiados a partir de los alineamientos multiples de secuencias aminoacidicas de lipasas con actividad a bajas temperaturas, que son las pertenecientes al grupo de lipasas sensibles a hormonas (HSL) de las especies procariontes. Esto permitio clonar y secuenciar el DNA que codifica parcialmente para una lipasa (240 pb, 80 aa). A partir del fragmento de gen de lipasa obtenido se determinaron las secuencias de los extremos 3 y 5 , mediante tecnicas de genome walking estandarizadas en el laboratorio. Se encontro un ORF de 1.293 pb, que codifica para un polipeptido de 431 aminoacidos y que presenta un 89% de identidad con una lipasa previamente descrita de Moraxella sp (lip2). Ademas, se identificaron dos regiones altamente conservadas: los peptidos HGGG y GDSAG que son motivos caracteristicos del grupo HSL. Tambien se obtuvieron las secuencias rio arriba y rio abajo de este gen. El gen de lipasa fue clonado en los vectores de expresion pET22b( +) Y pMAL-c2E y fue integrado exitosamente en las cepas E. coli BL21(D3E) y TBl. Las cepas seleccionadas fueron inducidas con IPTG para obtener la proteina lipasa recombinante. La lipasa producida por el sistema de expresion E. coli BL21(D3E)/pET22b(+) se obtuvo de forma insoluble, por 10 que no se continuo su caracterizacion, AI utilizar el sistema de expresion E. coli TB lIpMAL-c2E, se logro producir y purificar una proteina de fusion soluble de aproximadamente 90 kDa con actividad lipolitica. La temperatura a la cual se alcanzo la maxima actividad en las condiciones ensayadas fue de 20°C a pH 8.0 y la energia de activacion de 5,5 kcal/mol entre los 5 y 15°C en el mismo pH.

The use of adapted/active enzymes to low temperatures has a great potential in terms of lower energy costs, therapeutic applications and lower microbial contamination in industrial processes. Antarctic marine bacteria carry out their metabolism at very low temperatures, therefore they are particularly suitable for identifying such enzymes. Lipases are very useful lipolytic enzymes in the biotechnological industry. Their industrial application involve the food industry, chemical compounds synthesis, detergent industry, biopolymers and biodiesel synthesis, enantiomerical1y pure pharmaceutical compounds, agrochemistries like pesticides, flavours compounds, and cosmetic industry. A number of Antarctic sea water bacteria producing extra cellular lipolytic enzymes with high activity at low temperatures were isolated. The best one was selected to perform a 16S characterization which identified it as a Psychrobacter sp. The genomic DNA of this bacterium was used for a peR screening using primers obtained from lipases aminoacidic sequences multiple alignments active at low temperatures, which belong to the Hormone Sensitive Lipase (HLS) group of the prokaryotes species. These allowed cloning and sequence the DNA that partially encodes a novel lipase protein (240 bp, 80aa). Subsequently the complete gene was obtained by genomewalking technique standardized in the laboratory. An open reading frame of 1.293 bp was found, which encodes for a polypeptide of 431 amino acids, and presents 89% identity of a Moraxella sp. lipase gene previously described (lip2). Two conserved regions were identified in this sequence: the HGGG and the GDSAG peptides that are characteristic motifs of the HSL group. The promoter and downstream sequence of this gene were also obtained. The lipase gene was cloned into expression vectors pET22b( +) and pMAL-c2E and successfully integrated into E. coli BL21 (D3E) and TB 1. The selected ones were induced by IPTG to produce the recombinant lipase protein. The lipase produced by the E. coli BL21(D3E)/pET22b(+) expression system was insoluble, therefore its characterization was not continued. By using the E. coli TBlIpMAL-c2E expression system, a recombinant fusion protein with a molecular weight of 90 KDa was produced and purified with lipolytic activity. The maximum activity of the lipase was detected at 20°C and pH 8.0 in the assay conditions, and the activation energy was 5,5 kcal/mol between 5 and 15°C at the same pH.