Aislamiento, expresión y caracterización de un gen codificante para lipasa a partir de bacterias de orígen marino antártico
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2006Metadata
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Asenjo de Leuze de Lancizolle, Juan
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Aislamiento, expresión y caracterización de un gen codificante para lipasa a partir de bacterias de orígen marino antártico
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Abstract
EI uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial
en terminos de menores costos energeticos, aplicaciones terapeuticas y menor
contaminacion microbiana en procesos industriales. Las bacterias de origen marino
antartico mantienen su metabolismo a muy bajas temperaturas, por 10 que son
particularmente deseadas para la identificacion de dichas enzimas.
Las lipasas son enzimas lipoliticas de gran utili dad en la industria biotecnologica.
Sus aplicaciones involucran a la produccion alimenticia, de detergentes, farmacos
enantiomericamente puros, cosmeticos, sintesis de compuestos quimicos, de
biopolimeros y agroquimicos, entre otras.
Se aislaron bacterias de origen marino antartico, que producen enzimas lipoliticas
extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. Se selecciono la mejor cepa y se
realize un analisis del DNAr 16S, que identifico a la cepa como Psychrobacter sp. El
DNA genomico de este microorganismo se utilize para realizar una busqueda de un gen
de lipasa utilizando partidores disefiados a partir de los alineamientos multiples de
secuencias aminoacidicas de lipasas con actividad a bajas temperaturas, que son las
pertenecientes al grupo de lipasas sensibles a hormonas (HSL) de las especies
procariontes. Esto permitio clonar y secuenciar el DNA que codifica parcialmente para
una lipasa (240 pb, 80 aa). A partir del fragmento de gen de lipasa obtenido se
determinaron las secuencias de los extremos 3 y 5 , mediante tecnicas de genome
walking estandarizadas en el laboratorio. Se encontro un ORF de 1.293 pb, que codifica
para un polipeptido de 431 aminoacidos y que presenta un 89% de identidad con una
lipasa previamente descrita de Moraxella sp (lip2). Ademas, se identificaron dos regiones altamente conservadas: los peptidos HGGG y GDSAG que son motivos
caracteristicos del grupo HSL. Tambien se obtuvieron las secuencias rio arriba y rio
abajo de este gen. El gen de lipasa fue clonado en los vectores de expresion pET22b( +) Y
pMAL-c2E y fue integrado exitosamente en las cepas E. coli BL21(D3E) y TBl. Las
cepas seleccionadas fueron inducidas con IPTG para obtener la proteina lipasa
recombinante. La lipasa producida por el sistema de expresion E. coli
BL21(D3E)/pET22b(+) se obtuvo de forma insoluble, por 10 que no se continuo su
caracterizacion, AI utilizar el sistema de expresion E. coli TB lIpMAL-c2E, se logro
producir y purificar una proteina de fusion soluble de aproximadamente 90 kDa con
actividad lipolitica. La temperatura a la cual se alcanzo la maxima actividad en las
condiciones ensayadas fue de 20°C a pH 8.0 y la energia de activacion de 5,5 kcal/mol
entre los 5 y 15°C en el mismo pH. The use of adapted/active enzymes to low temperatures has a great potential in
terms of lower energy costs, therapeutic applications and lower microbial contamination
in industrial processes. Antarctic marine bacteria carry out their metabolism at very low
temperatures, therefore they are particularly suitable for identifying such enzymes.
Lipases are very useful lipolytic enzymes in the biotechnological industry. Their
industrial application involve the food industry, chemical compounds synthesis,
detergent industry, biopolymers and biodiesel synthesis, enantiomerical1y pure
pharmaceutical compounds, agrochemistries like pesticides, flavours compounds, and
cosmetic industry.
A number of Antarctic sea water bacteria producing extra cellular lipolytic
enzymes with high activity at low temperatures were isolated. The best one was selected
to perform a 16S characterization which identified it as a Psychrobacter sp. The
genomic DNA of this bacterium was used for a peR screening using primers obtained
from lipases aminoacidic sequences multiple alignments active at low temperatures,
which belong to the Hormone Sensitive Lipase (HLS) group of the prokaryotes species.
These allowed cloning and sequence the DNA that partially encodes a novel lipase
protein (240 bp, 80aa). Subsequently the complete gene was obtained by genomewalking
technique standardized in the laboratory. An open reading frame of 1.293 bp
was found, which encodes for a polypeptide of 431 amino acids, and presents 89%
identity of a Moraxella sp. lipase gene previously described (lip2). Two conserved
regions were identified in this sequence: the HGGG and the GDSAG peptides that are
characteristic motifs of the HSL group. The promoter and downstream sequence of this
gene were also obtained. The lipase gene was cloned into expression vectors pET22b( +)
and pMAL-c2E and successfully integrated into E. coli BL21 (D3E) and TB 1. The
selected ones were induced by IPTG to produce the recombinant lipase protein. The
lipase produced by the E. coli BL21(D3E)/pET22b(+) expression system was insoluble,
therefore its characterization was not continued. By using the E. coli TBlIpMAL-c2E
expression system, a recombinant fusion protein with a molecular weight of 90 KDa was
produced and purified with lipolytic activity. The maximum activity of the lipase was
detected at 20°C and pH 8.0 in the assay conditions, and the activation energy was 5,5
kcal/mol between 5 and 15°C at the same pH.
General note
Titulo Ingeniero en Biotecnología Molecular
Identifier
URI: https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/143979
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