Estudio de los requerimientos de factores generales de la transcripción (GTFs) y coactivadores en la transcripción dependiente de Homol D en Schizosaccharomyces pombe

Abstract

The transcription process is initiated by the Core Promoter Elements (CPE), leading the formation of the Pre-Initiation Complex (PIC) which reclutes the transcription proteins (General Transcription Factors, GTFs) and RNA Polymerase II (RNA Pol II) that bind to the CPE. These GTFs are: TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF and TFIIH in the case of promoter recognized by the RNA Pol II that synthesizes the mRNA molecule using DNA sequence as template. Among the CPE are the TATA box, the TFIIB-recognition Element (BRE), the Initiator (Inr), the Motif Ten Element (MTE), Downstream Promoter Element (DPE) and the Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006) Data collected during the laboratory experimental work suggest that the DNA sequence named Homol D is a universal CPE in S. pombe and that the genes containing this element are transcribed by the RNA Pol II, which is also the target of a new factor or protein complex that determined the initiation site of transcription. We aim to determine which GTFs are required for Homol D box dependent gene transcription, through in vitro transcription assays, inmunodepletion and Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA). Here we show the analysis of the following specific antibodies for GTFs of interest (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and the subunit of Srb4 mediator). xii Protein extract of S. pombe were used as GTFs source, while ribosomal K5 gene (that possess the Homol D box) were used as DNA template. To carry out transcription was used a purified RNA Pol II. The in vitro transcription and inmunodepletion experiments allowed us to observe that transcription does not occur when each transcription factor studied is depleted by using a specific antibody for each GTF. When using a promoter with an inverted Homol D as DNA template the same results were observed. When a rescue of the transcription reaction is performed by supplementing the depleted GTF after the inmunodepletion, the reaction occurred for both the normal and the inverted Homol D box. Therefore the studied GTFs, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH and TFIIF are necessary for initiation of the transcription process in the K5 promoter which contains Homol D box. For the EMSA assays it was initially obtained a purified protein fraction with Homol D union and antibodies against each GTF to make an inmunodepletion of each GTFs and afterwards the reaction was incubated with P32γATP labeled probe. This assays allowed us to observe that the studied transcription factors are not the ones that recognize directly the Homol D box sequence. According with the work performed in this work, the GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF and Srb4 are necessary for the formation of PIC but not for the recognition of the Homol D box in the K5 promoter, suggesting the existence of another factor/s o protein complex that recognizes the sequence of Homol D box.

El proceso de la transcripción es iniciado por los Elementos del Núcleo del Promotor (Core Promoter Element, CPE), que dirigen la formación del Complejo de Preiniciación (Pre-Initiation Complex, PIC), el cual está compuesto por los Factores de Transcripción Generales (General Transcription Factors, GTFs) y la RNA Polimerasa II (RNA Pol II). TBP, TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF y TFIIH corresponden a los GTFs que participan en la transcripción dirigida por promotores reconocidos por la RNA Pol II que sintetiza la molécula de mRNA a partir de una secuencia de DNA. Entre los CPE se encuentran la caja TATA, el elemento de reconocimiento de TFIIB (BRE), el Iniciador (Inr), el Motif Ten Element (MTE), el Downstream Promoter Element (DPE) y el Downstream Core Element (DCE) (Thomas y Chiang, 2006). Antecedentes recopilados durante el trabajo experimental de laboratorio sugieren que la secuencia de DNA denominada Homol D es un CPE universal en S. pombe y que los genes que poseen este elemento son transcritos por la RNA Pol II, la que además es blanco de un nuevo factor o complejo proteico que determina el sitio de inicio de la transcripción. Como objetivo de esta tesis se determinaron los requerimientos de GTFs necesarios para la transcripción de genes con promotores que poseen la caja Homol D, a través de ensayos de transcripción in vitro, inmunodepleción y geles de retardo (EMSA), en los cuales se utilizaron anticuerpos específicos para los distintos GTFs estudiados (TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y una subunidad del mediador Srb4). xiv Como fuente de GTFs se utilizaron extractos de proteínas del organismo S. pombe y como DNA molde fue utilizado el promotor del gen ribosomal K5 que posee la caja Homol D. Para llevar a cabo la transcripción se utilizó una RNA Pol II purificada. Los experimentos de transcripción in vitro e inmunodepleción, permitieron observar que la transcripción no ocurre al retirar cualquiera de los factores de transcripción por acción del anticuerpo específico para dicho GTFs. Además los ensayos usando como DNA molde un promotor con la caja Homol D invertida, permitieron observar los mismos resultados, es decir que la transcripción no ocurre al faltar alguno de los GTFs analizados en esta tesis. Al realizar un rescate de la reacción de transcripción, es decir, luego de hacer la inmunodepleción se suplementa el GTFs eliminado, se observó que la reacción ocurría, tanto para la caja Homol D normal como para la invertida, por lo tanto la presencia de todos los GTFs estudiados, TBP, TFIIB, TFIIE, TFIIH y TFIIF son necesarios para que se inicie el proceso de transcripción en el promotor K5 que posee la caja Homol D. Para los ensayos EMSA se utilizó extracto de proteínas totales que contenía la proteína con unión a Homol D y anticuerpos contra cada GTF, para realizar una inmunodepleción de ellos y luego se incubó con una sonda de DNA que contenía la caja Homol D marcada con P32γATP. Estos ensayos permitieron observar que los factores de transcripción estudiados no son los que reconocen de manera directa la secuencia de la caja Homol D, ya que a pesar de que ellos son retirados de la reacción se observa la aparición del complejo proteína/Homol D, reflejado como una banda en el film fotográfico. xv De acuerdo al trabajo realizado en este seminario de título, los GTFs TBP, TAF1, TFIIB, TFIIE, TFIIH, TFIIF y Srb4 son necesarios para la formación del PIC pero no para el reconocimiento de la caja Homol D en el promotor K5, sugiriendo que existiría otro factor o complejo proteico que reconoce la secuencia de la caja Homol D.