Determinación indirecta de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga EPA y DHA en posición sn-2 en triacilgliceroles mediante un método alternativo al método oficial AOCS Ch 3-91, utilizando la lipasa Rhizomucor miehei

Abstract

La literatura describe métodos para el análisis posicional sn-2 en triacilgliceroles. El más usado se basa en la ruptura de los ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-3 utilizando una lipasa pancreática, sin embargo, es un método laborioso y caro. De ahí, nace la necesidad de desarrollar un método más simple para el análisis de rutina. El objetivo de esta tesis es determinar indirectamente los ácidos grasos ubicados en la posición sn-2, con especial énfasis en los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga mediante un método enzimático alternativo utilizando la lipasa Rhizomucor miehei. En el desarrollo de la optimización del método se seleccionó el proceso más adecuado para purificar los triacilgliceroles utilizando una columna cromatográfica de vidrio, donde el óxido de aluminio actuó como compuesto adsorbente y el dietil éter como eluyente. Por otro lado, se optimizaron las condiciones de reacción enzimática con la lipasa del Rhizomucor miehei en manteca de cacao dada su composición de ácidos grasos (25,3; 36,8 y 33,4 g/100g para el ácido palmítico, esteárico y oleico, respectivamente) y su conocida distribución SOS, donde el ácido oleico insaturado ocupa preferentemente la posición sn-2. La optimización se realizó mediante un diseño estadístico donde las variables independientes fueron la temperatura, tiempo de reacción y cantidad de enzima, mientras que la dependiente fue la capacidad de desesterificación, expresada como porcentaje de corte de los ácidos grasos en posición sn-1 y sn-3. Los resultados indicaron que las condiciones óptimas para la actividad de la enzima fueron una temperatura de reacción de 61 °C, tiempo 10 min y la máxima cantidad de enzima que fue de 150 mg. Posteriormente, una muestra patrón de aceite de girasol enriquecida con trieicosapentanoina y tridocosahexanoina y un triacilglicerol estructurado con ácido caprílico y ácidos grasos poliinsaturados de origen marino fueron analizados en las condiciones de reacción óptimas previamente determinadas para la lipasa del Rhizomucor miehei. Los resultados obtenidos indicaron que la lipasa es capaz de cortar ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-3, sin embargo, la velocidad de desesterificación está altamente influenciada por la composición en ácidos grasos de la matriz lipídica evaluada y por el posible efecto de equilibrio que provocan los productos que se generan en el transcurso de la reacción. En las matrices manteca de cacao y triacilglicerol estructurado fue posible determinar los ácidos grasos presentes en la posición sn-2 en forma indirecta, a partir de la determinación de los ácidos grasos presentes en las posiciones sn-1 y sn-3, mediante un método enzimático menos tóxico, simple y más rápido que el método oficial AOCS Ch 3-91

The literature describes methods for positional analysis sn-2 triacylglycerols. The most used is based on the breakdown of fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions using a pancreatic lipase, according to the official AOCS method Ch 3-91, however, is a laborious and expensive. Hence, it comes the need to develop a simpler method for routine analysis. The aim of this thesis is indirectly determining fatty acids located at the sn-2 position, with special emphasis on the long-chain polyunsaturated fatty acids by alternative enzymatic method using Rhizomucor miehei lipase. In the development of the optimization method the most suitable process to purify selected triacylglycerols using a glass chromatography column, where the aluminum oxide was the adsorbent and the eluent was diethyl ether. Furthermore, the enzyme reaction conditions were optimized with Rhizomucor miehei lipase cocoa butter given its fatty acid composition (25.3, 36.8 and 33.4 g / 100g for palmitic acid, stearic and oleic respectively) and known distribution SOS where unsaturated oleic acid preferably occupies the sn-2 position. The optimization was performed using a statistical design in which the independent variables were temperature, reaction time and amount of enzyme, while the dependent variable was the ability to des-esterification, expressed as a percentage cut of fatty acids in position sn-1 and sn -3. The results indicated that the optimum conditions for enzyme activity were a reaction temperature of 61 °C, time 10 min and the maximum amount of enzyme was 150 mg. Subsequently, a standard sample of sunflower oil and enriched with tri-eicosapentanoic and tri-docosahexanoic and a structured triacylglycerol with caprylic acid and polyunsaturated fatty acids of marine origin were analyzed in the optimal reaction conditions previously determined for the Rhizomucor miehei lipase. The results showed that the lipase is able to cut fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions, however, the rate of des-esterification is highly influenced by the fatty acid composition of the lipid matrix and evaluated for the potential effect causing equilibrium products generated during the reaction. In cocoa butter and structured triacylglycerol it was possible to determine the fatty acids present in the sn-2 position indirectly from the determination of the fatty acids in the sn-1 and sn-3 positions, by an enzymatic method less toxic, simple and faster than the AOCS Official Method Ch 3-91