Estandarización y caracterización de un protocolo de reprogramación celular directa desde fibroblastos a neuronas siguiendo una estrategia farmacológica

Abstract

La comprensión del funcionamiento del sistema nervioso humano se ha dificultado por la inaccesibilidad del tejido y la incapacidad de los modelos celulares y animales de recapitular su fisiología. Adicionalmente, el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen al envejecimiento y a las enfermedades neurodegenerativas asociadas a él, se ha realizado históricamente utilizando animales jóvenes modificados genéticamente, que no han logrado reproducir con exactitud las patologías ni los fenotipos asociados a la vejez. Actualmente existen alternativas como la diferenciación de iPSC (del inglés induced pluripotent stem cell) o la reprogramación directa de células somáticas para obtener neuronas funcionales. Existe evidencia que la reprogramación directa permite que las células mantengan características asociadas a la edad de las células de inicio, lo que la convierte en una alternativa atractiva para el estudio del envejecimiento. Además de las estrategias de reprogramación directa basadas en la sobreexpresión de factores de transcripción, se han desarrollado alternativas como la reprogramación mediada por fármacos. Se ha reportado que es posible diferenciar directamente fibroblastos embrionarios de ratón (MEF, del inglés mouse embryonic fibroblast) a partir de un cóctel de fármacos (FICSB: Forskolina, ISX-9, CHIR990210, SB431542, I-BET151) que actúan sobre distintas vías de señalización y producen el cambio en el destino celular. Este seminario tiene como objetivo principal la estandarización de un protocolo de reprogramación directa aplicable a MEF y fibroblastos dermales murinos, que permitan caracterizar este proceso y desarrollar una prueba de concepto para posteriormente aplicar este protocolo a células derivadas de humanos. Con este objetivo, se realizaron cultivos primarios de MEF y la estandarización de un protocolo de obtención de fibroblastos dermales a partir de biopsias de piel de ratón. Se logró obtener poblaciones de MEF y de fibroblastos dermales, que son proliferativas y 2 susceptibles a la inducción neuronal. Posteriormente, las poblaciones obtenidas se sometieron a la reprogramación mediada por los fármacos FICSB y se obtuvieron neuronas inducidas. Se observó que las células experimentan cambios morfológicos drásticos, se determinó la eficiencia de la inducción a partir de la expresión de βIII-tubulina, que fue de aproximadamente 15% para los MEF. Se analizó mediante inmunocitoquímica la expresión de marcadores neuronales de citoesqueleto a los 7 y 12 días post inducción y se obtuvo que las neuronas inducidas a partir de MEF expresan los marcadores neuronales βIII-tubulina, pE-tubulina, MAP2 y tau-1, no obstante, su expresión es diferente a la que presentan las neuronas hipocampales primarias y no se observó expresión de marcadores de sinapsis, asociados a la madurez neuronal. Las inducciones sólo duraron 12-14 días debido a la alta tasa de muerte celular, por lo que se intentó disminuir la concentración de I-BET151, uno de los compuestos más citotóxicos del cóctel de fármacos. Se observó que, si bien aumenta la sobrevida, disminuye la eficiencia de la inducción. Adicionalmente, se comparó la eficiencia de la inducción entre MEF y fibroblastos dermales y se observó que los MEF son más susceptibles a la inducción neuronal. En conjunto, estos resultados aportan al desarrollo de una novedosa herramienta que nos permitirá estudiar el envejecimiento neuronal.

The comprehension of the human nervous system function so far has been difficult mainly due to the inaccessibility of the brain and live neurons and the lack of suitable animal and cellular models. Additionally, the study of the molecular mechanisms underlying aging and associated neurodegenerative diseases has been done historically in genetically modified young animal, that haven’t been able to reproduce these pathologies and other age-related phenotypes. There are strategies like iPSC differentiation or direct reprogramming to convert somatic cells into functional neurons. Moreover, directly reprogrammed cells retain aging-associated hallmarks and transcriptomic signatures, which make them an attractive alternative to study aging. Besides direct reprogramming based on ectopic expression of transcription factors, pharmacological approaches have been examined. Direct conversion of mouse embryonic fibroblasts (MEF) into functional neurons mediated by a small molecule cocktail (FICSB: Forskolin, ISX-9, CHIR990210, SB431542, I-BET151) has been reported, that targets different signaling pathways and allow the cell fate change. The main aim of this seminar is to standardize a direct reprogramming protocol in our laboratory that mediates MEF and mouse dermal fibroblasts conversion to induced neurons, to characterize the process and develop a proof of concept to eventually achieve direct reprogramming of human cells. First, we obtained primary MEF cultures and standardized a protocol to obtain dermal fibroblasts from mouse skin biopsies. We obtained proliferative MEF and dermal fibroblast populations, which are suitable for the neuronal induction protocol. Second, MEF and dermal fibroblast were treated with the induction medium and the small molecule cocktail and we obtained induced neurons (iN). We observed early and drastic morphological changes based on βIII-tubulin immunostaining and we estimated a 15% induction efficiency. Furthermore, other neuronal cytoskeleton markers expression were evaluated with 4 immunohistochemical analysis at day 7 and 12 post induction and we detected pE-tubulin, MAP2/tau-1 expression. Nevertheless, iN expression of these markers is lower than in primary neurons used as control and we did not detect synaptic markers expression, which are linked to neuronal maturation. To date, our chemical-based inductions have lasted 12-14 days due to high cell death rate during the reprogramming protocol. To promote higher cell survival and longer induction periods we decreased the I-BET151 concentration, which has been reported as the most cytotoxic compound of the cocktail. Indeed, we observed greater cell survival but also less efficiency. To evaluate the differences between MEF and dermal fibroblast induction we analyzed efficiency in both populations and observed that MEF are more likely to reprogram with this protocol. Together, these results contribute to developing a powerful strategy to study neuronal aging.