Ingeniería metabólica en Saccharomyces cerevisiae para la producción de isobutanol

Abstract

La producción de biocombustibles como fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles busca presentar nuevas maneras de obtención que sean renovables y amigables con el ambiente. Dentro de estos biocombustibles surgen los alcoholes de fusel, como el butanol, el cual, al ser comparado con el etanol, presenta ventajas en su uso como combustible. Por otro lado, Saccharomyces cerevisiae es una levadura que puede producir isobutanol a partir del catabolismo de valina, posee resistencia a altas concentraciones de alcoholes y condiciones favorables para el escalamiento y producción, lo que la hacen un modelo para la obtención de butanol; Sin embargo, una de las limitantes de este proceso, es su baja producción, por lo que existe un gran interés en lograr un aumento de ésta. Este trabajo se enfocó en obtener, mediante ingeniería metabólica en S. cerevisiae, cepas sobre productoras de isobutanol. Para esto se utilizó la ruta de Ehrlich, la cual naturalmente se realiza dentro de la mitocondria, exceptuando las dos últimas reacciones. Se seleccionaron las enzimas que catalizan estas dos reacciones, alcohol deshidrogenasa (LlADHARE1) y α-cetoisovalerato deshidrogenasa (SkARO10), provenientes de Lactococcus lactis y Saccharomyces kudriavzevii respectivamente, y, mediante la fusión del péptido señal de citocromo C oxidasa se destinaron a la mitocondria. Utilizando Gibson Assembly se ensamblaron estos genes a promotores y terminadores nativos de S. cerevisiae. La transformación se realizó por recombinación homóloga in vivo mediante electroporación con el fin de obtener transformantes estables. La integración de la construcción de interés se realizó en el cromosoma V en el gen URA3. La medición de la producción de alcoholes se realizó mediante HPLC. De este trabajo se obtuvieron finalmente cepas transformadas con el gen SkARO10 de S. kudriavzevii con una producción de isobutanol de 19 mg/L, logrando de esta manera observar que la trasformación con el gen α-cetoisovalerato deshidrogenasa con expresión mitocondrial logra incrementar la producción de butanol al doble. Se propone que, para incrementar aún más la producción, es necesario integrar el gen de una enzima del tipo alcohol deshidrogenasa y utilizar una cepa industrial con producción basal de isobutanol mayor.

Production of biofuels as an alternative energy source to fossil fuels looks for renewable and environmentally friendly alternatives. Fusel alcohols, such as butanol, have advantages as a fuel compared to ethanol. Saccharomyces cerevisiae is a yeast that has the biosynthetic route for isobutanol, high alcohol-resistance and favourable conditions for scaling-up and production. These features make S. cerevisiae a promising cell-factory for the production of butanol; however, this yeast naturally produces low quantities of this alcohol, which is a limitation to the process. Thus, there is a great interest in developing strains that over-produce isobutanol. The aim of this work was to obtain over-producer strains of isobutanol, by means of metabolic engineering of S. cerevisiae using the Ehrlich pathway, which occurs inside the mitochondria except the last two reactions. The enzymes that catalyze these two reactions were selected, alcohol dehydrogenase (LlADHARE1) and α-ketoisovalerate dehydrogenase (SkARO10) from Lactococcus lactis and Saccharomyces kudriavzevii respectively, and fused to the cytochrome C oxidase signal peptide for sorting to mitochondria. The Gibson Assembly technique was used to assemble these genes to native promoters and terminators from S. cerevisiae. To obtain stable transformants, the transformation was carried out by in vivo homologous recombination by electroporation. The construct was integrated in the chromosome V in URA3 gene. Transformed strains with gene SkARO10 from S. kudriavzevii produced 19 mg/L of isobutanol, indicating that transformation with the gene α-ketoisovalerate dehydrogenase with mitochondrial sorting increases production of butanol two-fold. Additionally, to reach higher levels of butanol production, integration of alcohol dehydrogenase, is needed, in addition to use an industrial strain with a higher basal production of isobutanol.