Los plásmidos de piscirickettsia salmonis: desarrollo de un modelo alternativo para el estudio comparativo de sus factores de virulencia y la respuesta del hospedero a la infección

Abstract

Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena intracelular facultativa que causa la Septicemia Rickettsial de Salmónidos (SRS). Esta bacteria coloniza diversos tejidos y órganos, lo que culmina con la septicemia y muerte del animal. Es capaz de sobrevivir al interior de macrófagos, y se multiplica en ellos al interior de vacuolas replicativas unidas a la membrana celular. Esta forma de replicación es similar a la observada en bacterias relacionadas filogenéticamente, como las del género Francisella, Coxiella y Legionella. Los patógenos de estos géneros además comparten la presencia de plásmidos que se relacionan con la virulencia de la cepa que los posee, y codifican factores de virulencia (FdeV) como el sistema de secreción Dot/Icm, el cual ha sido descrito en P. salmonis. Mediante secuenciación, se han identificado de plásmidos en P. salmonis, cuya función no ha sido estudiada. En este trabajo se analizaron las secuencias codificantes contenidas en 4 plásmidos de P. salmonis LF-89, se identificaron genes de replicación y mantención, profagos, sistemas toxina-antitoxina, y FdeV. Estos probables FdeV tienen homólogos en todas las cepas secuenciadas de P. salmonis y se expresan en condiciones de infección en cultivos celulares SHK-1 y ASK derivados de Salmo salar y en cultivos primarios de riñón (CPR) de pez cebra (Danio rerio), utilizado como un modelo alternativo de infección. En todos ellos P. salmonis fue capaz de infectar, disminuyó la viabilidad celular y permaneció por al menos 12 días al interior de las líneas celulares, y 5 días en los CPR, según se observó por inmunofluorescencia. En las células de salmón, la bacteria causó un aumento en la expresión de il8, il10 e il12, y una disminución en los transcritos de ifn-γ, generando un ambiente antiinflamatorio. En los CPR infectados, generó un ambiente proinflamatorio producto de un aumento de la expresión de il6, ifn-γ y nos2a, aunque también se observó replicación de P. salmonis en ellos. Esto sugiere que los cultivos celulares responden de forma distinta a la infección por esta bacteria. En P. salmonis aumentó la expresión de genes relacionados sistemas de secreción (Dot/Icm y posiblemente la maquinaria del flagelo), toxinas y proteínas secretadas y genes plasmidiales, lo que indica que los plásmidos cumplen un rol en la infección bacteriana. Destacó la sobreexpresión de 3 copias pipB2, y la expresión diferencial de ficD, que aumentó significativamente sólo en células SHK-1, lo que se correlaciona con la formación de grandes vacuolas citoplasmáticas sólo en este tipo celular.

Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular pathogen, and the etiological agent of Salmonid Rickettsial Septicemia (SRS). This bacterium colonizes fish tissues and organs, causing septicemia and death of the animal. P. salmonis is able to survive inside the macrophages, and replicates in citoplasmic vacuoles attached to the cell membrane. This form of replication is similar to that observed in phylogenetically related bacteria, such as Francisella, Coxiella and Legionella. Pathogens of these genera also contains plasmids that are implicated in the virulence of the strain. These plasmids encode virulence factors (VF) such as the Dot / Icm secretion system, which has been also described in P. salmonis. After long read sequencing of P. salmonis genome, four distinct plasmid sequences were predicted in P. salmonis LF-89 strain, but their function is unknown. In this work, we analyzed the coding sequences of P. salmonis LF-89 plasmids and identified replication and maintenance genes, profagos, toxin-antitoxin systems, and VFs. Homologous genes were identified in all P. salmonis sequenced strains and the putative VFs were expressed in infected salmon cells (SHK-1 and ASK cultures), and in infected primary cell cultures derived from zebrafish kidney (ZFPCC), used as an alternative infection model. In those cultured cell types, P. salmonis was able to infect, decreased cell viability and remained inside the cells for at least 12 days for the cell lines, and 5 days for the ZFPCC, as observed by immunofluorescence assays. In salmon cells, the bacterium caused an increase expression of il8, il10 and il12, and a down-regulation of ifn-γ, generating an anti-inflammatory environment. Although bacterial replication occured in the infected ZFPCC, P. salmonis generated a proinflammatory environment, as a result of the up-regulation of il6, ifn-γ and nos2a. This suggests that cell cultures respond in different ways to P. salmonis infection. During infection, genes related to secretion systems (Dot / Icm and possibly the flagellum structure), toxins and secreted proteins and plasmid genes were overexpressed in the bacteria. These results suggests that P. salmonis plasmids have an important role in bacterial infection. In particular, the overexpression of three pipB2 gene copies, and the differential expression of ficD, which increased significantly only in SHK-1 cells, correlates with the formation of large cytoplasmic vacuoles that took place only in this cell type.