Regulación del acoplamiento mitocondriaretículo endoplásmico y el metabolismo mitocondrial durante el estrés proteotóxico mitocondrial

Abstract

La acumulación de proteínas mal plegadas dentro de las mitocondrias genera una respuesta transcripcional adaptativa, denominada UPR mitocondrial. A través de esta respuesta, las mitocondrias señalizan hacia el núcleo para aumentar la expresión de genes que permiten restaurar la homeostasis proteica. Sin embargo, se desconoce si además de esta respuesta genética, existe un cambio adaptativo en el metabolismo celular en las etapas tempranas del estrés mitocondrial. El acoplamiento físico-funcional del retículo endoplásmico (RE) con la mitocondria es uno de los principales reguladores del metabolismo mitocondrial, el cual permite el traspaso directo de Ca2+ entre ambos organelos. En la mitocondria, el Ca2+ actúa como cofactor de enzimas que participan en el ciclo de Krebs, potenciando la producción de ATP. No obstante, actualmente no existe información sobre posibles cambios en el acoplamiento mitocondria-RE y su papel durante el estrés mitocondrial. A partir de estos antecedentes, se planteó como hipótesis de esta tesis que la acumulación de proteínas mal plegadas al interior de la mitocondria (UPR mitocondrial) favorece el aumento del metabolismo mitocondrial y el incremento en el contacto funcional entre mitocondria y RE. Para responder esta hipótesis se trabajó con la línea celular HeLa, induciendo el estrés mitocondrial mediante el tratamiento con doxiciclina, antibiótico que inhibe la traducción de proteínas en la mitocondria. De esta forma, se produce un desbalance entre la expresión de las subunidades nucleares y mitocondriales de los complejos respiratorios lo que lleva a estrés por acumulación de proteínas no ensambladas. En estas condiciones se estableció que el tratamiento con doxiciclina produce, entre las 24 y 72 h, un desbalance mito-nuclear de proteínas que son parte de los complejos respiratorios e induce la respuesta frente a este estrés en cuanto a expresión de marcadores de la UPR mitocondrial (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), sin afectar la viabilidad celular. Por otra parte, a tiempos cortos de tratamiento, de entre 2 y 4 h, la doxiciclina aumentó los parámetros metabólicos celulares, como los niveles totales de ATP y el consumo de oxígeno. A estos mismos tiempos de tratamiento, doxiciclina incrementó los contactos físicos y funcionales entre mitocondrias y RE, evaluados mediante colocalización por inmunofluorescencia indirecta y cinéticas de captación de Ca2+ mitocondrial por microscopía confocal. Se puede concluir que el estrés mitocondrial inducido por doxiciclina estimula el acoplamiento RE-mitocondria y una potenciación del metabolismo celular a tiempos tempranos. Estos resultados sugieren que esta respuesta metabólica favorece la adaptación celular frente al estrés mitocondrial

The accumulation of unfolded proteins within the mitochondria generates an adaptive transcriptional response, denominated mitochondrial UPR. Through this response, the mitochondria signal back towards the nucleus to increase gene expression that allow restoring protein homeostasis. However, it is still unknown whether, in addition to this genetic response, there is an adaptive change in cell metabolism in the early stages of mitochondrial stress. The physical-functional coupling of the endoplasmic reticulum (ER) with the mitochondria is one of the main regulators of mitochondrial metabolism, which allows the direct transfer of Ca2+ between both organelles. In mitochondria, Ca2+ acts as a cofactor of enzymes involved in the Krebs cycle, enhancing ATP production. However, there is currently no information on possible changes in mitochondrial-ER coupling and its role during mitochondrial stress. From this background, we hypothesized that the accumulation of unfolded proteins inside the mitochondria (mitochondrial UPR) favours the increase in mitochondrial metabolism and in the functional contact between mitochondria and ER. To address this hypothesis, we worked with the HeLa cell line, inducing mitochondrial stress by treatment with doxycycline, an antibiotic that inhibits the translation of mitochondrial-encoded proteins. In this way, there is an imbalance between the expression of nuclear and mitochondrial subunits of the respiratory complexes leading to a stress by accumulation of non-assembled proteins. Under these conditions, we established that the treatment with doxycycline produces a mito-nuclear imbalance of the proteins, between 24 and 72 h, that are part of the respiratory complexes and induces the response against this stress as an expression of the mitochondrial UPR markers (CHOP, C/EBPβ, ClpP, mtHsp60), without affecting cell viability. On the other hand, at short treatment times (between 2 and 4 h), doxycycline increased cellular metabolic parameters, such as total ATP levels and oxygen consumption. At these times, doxycycline increases the physical and functional contacts between mitochondria and ER, evaluated by indirect immunofluorescence colocalization and kinetics of mitochondrial Ca2+ uptake using confocal microscopy. In summary, the mitochondrial stress induced by doxycycline stimulates an early mitochondrial-RE coupling and potentiates cell metabolism. These results suggest that this metabolic response favours cellular adaptation to mitochondrial stress