Búsqueda e identificación de relaxasas y genes mob en el ambiente marino

Abstract

El océano comprende el 71% de la superficie de la Tierra, participando en el control del clima, y proveyendo más del 50% del oxígeno disponible en la atmósfera. Las comunidades microbianas que habitan los ambientes marinos se caracterizan por ser determinantes en la producción primaria, además de ser diversas en sus funciones y distribución, siendo fundamentales en la mantención de los ciclos biogeoquímicos. Éstas poseen distintas estrategias para habitar estos ambientes, ya que en estos existen variaciones en los factores abióticos, tales como temperatura, disponibilidad de oxígeno o salinidad, que determinan cambios a nivel biótico. El dinamismo de los ambientes marinos favorece el intercambio de información genética mediado por la transferencia horizontal de genes (HGT). Está descrito que la conjugación es el mecanismo que posee una mayor tasa de ocurrencia en estos ambientes, por lo que estudiar los elementos genéticos móviles (EGM) conjugativos resulta necesario para comprender que genes son potencialmente transferidos. Este proceso se inicia cuando la enzima relaxasa, codificada por el EGM identifica el origen de transferencia (oriT) en el ADN del elemento a transferir, y realiza el corte con el que se inicia la movilización del elemento conjugativo a la célula receptora por medio del sistema de secreción de tipo IV (T4SS). Esta misma relaxasa es la que empalma el ADN transferido. Lo particular de esta enzima, es que es un elemento ubicuo para los elementos conjugativos, lo que la convierte junto a los genes que la codifican (genes mob) en marcadores de movilidad génica por conjugación, y por tanto en un sistema de clasificación de estos elementos. Se ha descrito que los genes transferidos en plásmidos movilizables o conjugativos son capaces de conferir capacidades adaptativas a determinados microorganismos, tales como resistencia a antibióticos o a metales pesados, mientras que a nivel comunitario su efecto aún requiere de mayor estudio. En este seminario de título se planteó la búsqueda e identificación de relaxasas y genes mob, tanto in sílico como in situ, en muestras marinas de la región de Valparaíso. In sílico, se identificaron 28 proteínas con dominios funcionales descritos para relaxasas mediante la utilización de modelos ocultos de Markov (HMM) en un metagenoma obtenido desde el proyecto “TARA Oceans”, correspondiente a una estación ubicada frente a las costas de la región central de Chile, realizando además una cuantificación de los genes mob correspondientes a las proteínas identificadas, obteniendo que más del 70% de las lecturas reclutadas respondían a sólo dos familias de relaxasas (MOBP y MOBH). Para el estudio in situ se analizaron muestras marinas colectadas de una zona intermareal en Montemar, región de Valparaíso, en los meses de enero, marzo y julio de 2018. Estas muestras se trataron utilizando distintos protocolos de extracción de ADN, diferenciando ADN total y ADN plasmidial. Se evaluó la presencia de genes codificantes para relaxasas en los distintos tratamientos de las muestras mediante DPMT (Degenerate Primer Mob Typing) donde se logró identificar la presencia de la familia MOBQu mediante esta técnica. Posteriormente se realizó una cuantificación del gen codificante para esta familia mediante q-PCR, obteniendo que la muestra extraída con un kit comercial para extracción de ADN plasmidial se encontraba enriquecida en estos genes. Con estos resultados podemos demostrar que estas estrategias permitieron la identificación de relaxasas y los genes que las codifican en sistema marino, y así inferir la presencia de elementos conjugativos en estos.

The ocean comprises 71% of the Earth's surface, participating in climate control, and providing more than 50% of the oxygen available in the atmosphere. The microbial communities that inhabit marine environments are characterized by being determinant in primary production, diverse in their functions and distribution, and fundamental in the maintenance of biogeochemical cycles. These communities have different strategies to inhabit these environments, since in these there are variations in the abiotic factors, such as temperature, availability of oxygen or salinity, which determine changes at the biotic level. The dynamism of marine environments favors the exchange of genetic information by horizontal gene transfer (HGT). It is reported that conjugation is the mechanism that has a higher rate of occurrence in these environments, so studying the conjugative mobile genetic elements (EGM) is necessary to understand which genes are potentially transferred. This process is initiated when the relaxase enzyme, encoded by the EGM, identifies the origin of transfer (oriT) in the DNA of the element to be transferred, and performs the cut with which the mobilization of the conjugative element to the recipient cell is initiated through the Type IV secretion system (T4SS). This same relaxase enzyme is the one that splices the transferred DNA. A particular issue about this enzyme is that it is a ubiquitous element for the conjugative elements, which converts it together with the genes that code it (mob genes) into markers of gene mobility by conjugation, and therefore in a classification system of these elements. It has been reported that genes transferred in mobilizable or conjugative plasmids are able to confer adaptive capacities to certain microorganisms, such as resistance to antibiotics or heavy metals, while at the community level their effect still requires further V-ix study. In this work we proposed the search and identification of relaxases and mob genes, both in silico and in situ, in marine samples from the Valparaíso region. In silico, 28 proteins with functional domains described for relaxases were identified by using hidden Markov models (HMM) in a metagenome obtained from the "TARA Oceans" project, corresponding to a station located off the coasts of the central region of Chile, also carrying out a quantification of the mob genes corresponding to the identified proteins, obtaining that more than 70% of the readings recruited responded to only two families of relaxases (MOBP and MOBH). For the in situ study, marine samples collected from an intertidal zone in Montemar, Valparaíso region, in the months of January, March and July 2018 were analyzed. These samples were subjected to different protocols for total DNA and plasmid DNA extraction, evaluating the presence of genes coding for relaxases in the different treatments of the samples by means of DPMT (Degenerate Primer Mob Typing) where it was possible to identify the presence of the MOBQu family. A quantification of the gene coding for this family was performed by q-PCR, obtaining that the sample extracted with a commercial kit for plasmid DNA extraction was enriched in these genes. With these results we can demonstrate that these strategies allowed the identification of relaxases and the genes that codify them in the marine system, and thus infer the presence of conjugative elements in them.