Modularidad en interruptores optogenéticos basados en la arquitectura de doble híbrido en levaduras: sistema Fungal Light-Oxygen-Voltage como caso de estudio

Abstract

Los fotorreceptores se encuentran ampliamente distribuidos en todos los dominios de la vida, y se caracterizan por experimentar cambios de conformación inducidos por la presencia o ausencia de luz. Estas moléculas, junto con distintas herramientas ópticas, han permitido la aparición de la optogenética, que consiste en el uso de luz para permitir el comando de distintos procesos biológicos con un fino control espacio-temporal. El uso de luz como tratamiento inductor se destaca debido a que es una señal fácil de regular y con gran resolución espacial, popularizando su uso en sistemas mamíferos. Recientemente, el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae ha sido también adoptado como una plataforma para este tipo de aproximaciones, ya que no presenta fotorreceptores descritos, y por lo tanto, no es capaz de sensar la luz. Recientemente, se ha descrito un sistema optogenético llamado Fungal Light- Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este se basa en la interacción de los dominios LOV de las proteínas WHITE COLLAR 1 (WC-1) y VIVID (VVD) del hongo Neurospora crassa, y en la arquitectura clásica de los sistemas de doble híbrido. FUN-LOV presentó notables niveles de inducción en la transcripción de un gen reportero luciferasa, y bajo ruido en condiciones de oscuridad, por lo que se presenta como uno de los sistemas optogenéticos más robustos reportados hasta la fecha. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel que cumplen los distintos dominios de las proteínas que participan en este tipo de arquitectura para la funcionalidad y robustez del sistema optogenético. Es por esto que este seminario de título se presenta como una revisión de la modularidad y robustez del sistema FUN-LOV. Para esto se intercambiaron los dominios de unión a DNA (DBD) y de activación (AD) del sistema original por el de diferentes factores de transcripción (TF), ampliamente descritos en S. cerevisiae, tales como el DBD de las proteínas LexA y Cup2p, y el AD de VP16. Con el objetivo de realizar esta evaluación se generaron las correspondientes construcciones genéticas in silico, para luego ensamblarlas in vivo usando clonamiento por recombinación en levaduras. La evaluación de los sistemas se realizó de forma indirecta a través de la cuantificación de la actividad del gen reportero luciferasa (LUC) en respuesta a luz azul (BL) y al estímulo particular de cada dominio intercambiado (cobre, luz roja). Como resultado se obtuvo que ambos sistemas en los que se hizo un cambio a nivel de DBD/promotor, presentaron una pérdida en su funcionalidad y robustez, lo que sugiere fuertemente que dichos módulos son de vital importancia para este tipo de sistemas optogenéticos. Por su parte, el sistema FUN-LOV VP16 mantuvo su funcionalidad como interruptor-optogenético, pero presentó un menor nivel de inducción de actividad luciferasa, además de una cinética más lenta comparado con el sistema ya reportado. Finalmente, se concluye que el sistema FUN-LOV no es modular a nivel de DBD/promotor, ya que al remplazar estos módulos el sistema pierde su funcionalidad y robustez. Por otro lado, el sistema es modular a nivel de AD, ya que mantiene su funcionalidad, mientras que la robustez varía dependiendo de la naturaleza del AD a utilizar.

Photoreceptors are widely distributed in all the domains of life and are characterized by undergoing conformational changes induced by the presence or absence of light. These molecules, together with different optical tools, have allowed the appearance of optogenetics, which involves the use of light to allow the command of different biological processes with a fine spatio-temporal control. Light as an inducer treatment is remarkable since it is easy to regulate and provides great spatial resolution, which has boosted its use in mammalian systems. Recently, the model organism Saccharomyces cerevisiae has been adopted as an ideal platform for this kind of systems, due to the absence of described photoreceptors, and therefore, it is not capable to sense the light. Recently, an optogenetic system called FUN-LOV has been described. FUN-LOV is based on the interaction of Neurospora crassa photoreceptors WC-1 and VVD, and on the classical architecture of the double hybrid systems. FUN-LOV showed remarkable levels of luciferase gene expression, and low noise in dark conditions, so it is presented as one of the most robust optogenetic systems reported so far. Nonetheless, little is known about the role played by the different protein domains for the functionality and robustness of the optogenetic system. Therefore, this title seminar is presented as a revision of modularity and robustness of the FUN-LOV system. For this, the DBD and AD of the original system were exchanged for different TF domains widely described in S. cerevisiae, such as the DBD of the LexA and Cup2 proteins, and the AD of VP16. The evaluation was carried out generating the genetic constructions in silico, to then assemble them in vivo using yeast recombinational cloning. The evaluation of the systems was performed indirectly through the activity quantification of LUC reporter gene in response to BL and the particular stimulus for each domain exchanged (copper, red light). As results, a loss of functionality and robustness was observed when the domains where exchanged at the DBD/promoter level, strongly suggesting that these modules are crucial for this type of optogenetic systems. On other side, the FUN-LOV VP16 system keep its functionality as an opto-switch, but showed a lower induction of luciferase activity, and slower kinetics in relation with the already reported system. Finally, we concluded that FUN-LOV is not a modular system at the DBD/promoter level, because functionality and robustness of the system are lost when these modules were replaced. Nonetheless, the system is modular at the AD level, since it maintained its functionality, meanwhile the robustness varies depending on the nature of the AD used.