Efecto de citoquinas pro-inflamatorias sobre la metilación del DNA de los promotores de genes de la respuesta a proteínas mal plegadas en glándulas salivales de pacientes con Síndrome de Sjögren

Abstract

síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica, inflamatoria y sistémica que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lagrimales. Resultados de nuestro laboratorio demuestran que las células acinares de las GS de pacientes SS presentan estrés de retículo endoplásmico (RER) y un aumento en la expresión del sensor ATF6α y del factor de transcripción ATF4 de la vía PERK de la respuesta a proteínas mal plegadas. También, se ha determinado niveles variables de transcrito de la chaperona calreticulina (CALR). Considerando el rol relevante que se le ha atribuido a la epigenética en la patogénesis de otras enfermedades autoinmunes surge la pregunta: ¿Es posible que la expresión diferencial de ATF4, ATF6α y CALR en GS de pacientes SS pueda estar regulada por mecanismos epigenéticos, tal como la metilación del DNA? Para determinarlo se evaluó el porcentaje de metilación del DNA de los respectivos promotores utilizando MS-HRM y los resultados se correlacionaron con los datos clínicos de los pacientes SS. Interesantemente, las GS de pacientes SS han mostrado que las células epiteliales contribuyen con el ambiente inflamatorio al sobreexpresar citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IFN-. En esta tesis se determinó el efecto de IFN- y TNF-α en la metilación de los promotores de los genes de interés en acinos 3D. Con el propósito de averiguar si los cambios observados se relacionaron con las enzimas metilasas y desmetilasas, es que se determinaron los niveles de transcrito de DNMT1, DNMT3A y TET2. Los resultados obtenidos en GS labiales de pacientes SS comparado con controles mostraron: 1. un aumento significativo en la metilación del DNA para el promotor del gen de ATF4 que se correlacionó positivamente con los niveles de transcritos de TNF-α e IFN-, 2. una disminución de la metilación del promotor del gen de ATF6α que se correlacionó negativamente con los niveles de los transcritos de las citoquinas evaluadas, y 3. no se encontraron cambios en la metilación del promotor de CALR. Paralelamente, se determinó que el porcentaje de metilación del promotor de ATF6α correlacionó negativamente con los autoanticuerpos ANA. Sin embargo, es complejo establecer cuáles son los blancos antigénicos que dan cuenta de esta correlación. Asimismo, las correlaciones clínicas obtenidas validan la muestra de pacientes utilizada en este estudio, mostrando que la inflamación se asocia al daño glandular y consecuentemente a la alteración de la función de las GS. En los acinos 3D estimulados por 24 h con TNF-α o IFN- (1 y 10 ng/mL) se corroboró lo observado en GSL de pacientes SS, evidenciando un aumento del porcentaje de metilación del promotor del gen de ATF4, una disminución del promotor del gen de ATF6α y no cambios en CALR. Por otra parte, la metilación del promotor de los genes de ATF4 y de ATF6α correlacionó negativamente con los niveles de transcritos respectivos. Paralelamente, los niveles de transcritos de DNA-metiltransferasas (DNMT1, DNMT3A) y la desmetilasa TET2 aumentaron significativamente en acinos 3D estimulados con citoquinas. Este aumento en los niveles de transcritos explicaría, en parte, la metilación diferencial del promotor de ATF4 y de ATF6α bajo las condiciones de estudio. Por lo tanto, las citoquinas proinflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores de los genes estudiados. Además, los niveles de transcritos de metilasas y desmetilasa se podrían incidir en la metilación diferencial de los promotores de ATF4 y ATF6α bajo las condiciones del estudio. En conclusión, las citoquinas pro-inflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores génicos ATF4 y ATF6α y, estos cambios en la metilación de los promotores podrían contribuir a la regulación de la UPR en las GSL de pacientes con SS.

Sjögren's syndrome (SS) is a chronic, autoimmune, inflammatory and systemic exocrinopathy that mainly affects salivary glands (SG) and lacrimal glands. Results from our laboratory demonstrate that SG acinar cells from SS patients show stress in the endoplasmic reticulum and an increased expression of ATF6α sensor and ATF4 transcription factor, member of the PERK pathway of the unfolded protein response. Also, SS patients showed variable levels calreticulin transcript levels (CALR). Considering the relevant role attributed to epigenetics in the pathogenesis of autoimmune diseases, the question arises: Is it possible that the differential expression of ATF4, ATF6α and CALR in SG from SS-patients could be regulated by epigenetic mechanisms, such as DNA methylation? The percentage of DNA methylation of the ATF4, ATF6α and CALR gene promoters were evaluated using methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM). Results were correlated with the clinical data of SS patients. Interestingly, SG from SS-patients has shown that epithelial cells contribute to the inflammatory environment by overexpressing relevant pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ. In this thesis we determined the effect of IFN-γ and TNF-α on methylation of promoters of the genes of interest in 3D acini. To determine if the observed changes were related to the levels of methylase and demethylase enzymes, transcript levels of DNMT1, DNMT3A and TET2 were determined. The results obtained in labial SG (LSG) of SS patients compared with controls showed: 1. a significant increase of DNA methylation in ATF4 gene promoter that positively correlated with TNF -α and IFN-γ transcript levels, 2. a significant decrease in DNA methylation in ATF6α gene promoter that negatively correlated with TNF-α and IFN-γ transcript levels, 3. no changes were found in the methylation of the CALR promoter. The methylation of the ATF6α promoter correlated negatively with ANA antibodies levels. However, it is complex to establish the antigenic targets that account for this correlation. Aditionally, the clinical correlations obtained validate the set of patients used in this study showing that the inflammation is associated with the glandular damage and consequently to the alteration of the GS function. Results observed in LSG of SS patients were confirmed in 3D acini stimulated with TNF-α or IFN-γ (1 and 10 ng/mL) for 24 h, showing an increase in the methylation percentage of the ATF4 gene promoter, a decrease of the ATF6α gene promoter and no changes in CALR. On the other hand, promoter methylation of the ATF4 and ATF6α genes negatively correlated with their respective transcript levels. In parallel, levels of DNA-methyltransferase transcripts (DNMT1, DNMT3A) and TET2 desmethylase increased significantly in cytokine-stimulated 3D acini. These results could partly explain the differential methylation of the ATF4 promoter and ATF6α under the present experimental conditions. Therefore, proinflammatory cytokines promote changes of promoter DNA methylation of the studied genes. Comparatively, levels of methylase and desmethylase transcripts could influence the differential methylation of ATF4 and ATF6α promoters under conditions studied. In conclusion, proinflammatory cytokines promote changes in the methylation of ATF4 and ATF6α promoters and these changes in DNA methylation would contribute to the regulation of UPR in the LSG of patients with SS.