Behavioral and physiological effects of triadimefon in zebrafish are associated with alterations of the dopaminergic and serotonergic pathways

Abstract

Triadimefon (TDF) is a triazole fungicide extensively used in agriculture that has been found as a pollutant in numerous water sources. In mammals, it inhibits monoamine uptake through the binding to the dopamine transporter, with a mechanism of action similar to cocaine, resulting in higher levels of dopamine at the synapse. Dopamine is a catecholaminergic neurotransmitter involved in a broad spectrum of processes such as locomotion, cognition, reward, and mental disorders. In addition, at the hypothalamus-pituitary level dopamine participates as an inhibitory factor in prolactin (PRL) secretion by its binding to D2-like receptors. In this work we have studied, for the first time, the neurotoxic effects of TDF on embryos, larvae and adult zebrafish and its connection with changes in the dopaminergic and serotonergic systems. Since hatching is used in bioassays to quantify the effect of stressors like TDF, we started evaluating how the chronic exposure to TDF affected the secretory function of the hatching gland cells (HGC) present in the embryos. Hatching is the process by which the embryo emerges from the egg and in zebrafish takes place at 2 dpf (days post fertilization). It involves the lysis of the chorion by the action of the hatching enzymes (HE), which are secreted due to the stimulatory effect of PRL. We observed that the treatment with 35 mg/L of TDF starting at 36 hpf (hours post fertilization), produced a retention of the HGC enzymes until 4 dpf, an effect that could be reversed by D2 receptor antagonist, but not D1. This result was also congruent with changes in prl expression. Besides, the phenotype given by TDF on HGC was reproduced using mutants for the rate limiting enzyme in catecholamine synthesis, tyrosine hydroxylase (TH1), suggesting an evident involvement of dopamine in the release of HGC. Given the similarities of TDF with cocaine, we also decided to assess the effects of TDF on behavior. We evaluated the acute exposure of 5 dpf larvae to different concentrations of TDF, ranging from 5 mg/L to 35 mg/L. The lowest concentration did not alter neither locomotor activity nor dopamine levels but produced a reduction in extracellular serotonin and had an anxiolytic-like effect, supported by a decrease in cortisol production. On the other hand, an increase in the concentration of TDF produced a dose-dependent reduction in locomotion, which could be reversed or enhanced by D1 (SCH-23390) or D2 (Haloperidol) dopamine receptor antagonists, respectively. Using in vivo electrochemistry, we show that 35 mg/L of TDF increases the levels of dopamine in the brain, which it is contradictory since an augment in dopamine signaling is usually linked to an increase in movement, suggesting that the effects on locomotion exerted by TDF are probably controlled by other pathways such as serotonergic. To determine how dopamine affects locomotor activity we used zebrafish larvae genetically depleted of dopamine, which presented a reduced locomotor activity as reported in mammals. The results obtained with the larvae were dramatically opposed to those reported with adult mammals. To determine whether it was an effect depending on development or specie we used adult zebrafish. We observed that the exposure to 5 mg/L of TDF increases anxiety and aggressiveness, while 15 mg/L had a stimulatory effect over locomotion, which coincides with the behaviors observed in mammals. With these results, it was also interesting to determine if TDF shared other similarities with cocaine, such as reward and addiction. The same concentration that produced an anxiety-like behavior was linked to conditioned place aversion (CPA), whereas the exposure to higher levels of TDF promoted the development of conditioned place preference (CPP). These results could be explained considering that 5 mg/L of TDF could be diminishing serotonin levels in the amygdala, leading to an anxiety-like behavior. Then, the constant exposure to TDF would produce fear conditioning and aversion to the pattern linked to the drug. On the other hand 15 mg/L of TDF increases extracellular dopamine, which could be stimulating the reward system producing preference for the pattern associated with TDF. In this work we show the behavioral and physiological effects of TDF in larvae and adult zebrafish, providing evidence that the effects are mediated through the perturbation in monoamine activity. We propose that dopamine is the principal neurotransmitter involved in the locomotion, HE secretion and CPP exerted by TDF, whereas serotonin would be playing a role in the anxiety-like behaviors, CPA and probably also in locomotion .

Triadimefon (TDF) es un fungicida triazólico ampliamente utilizado en agricultura encontrado como contaminante en numerosas fuentes de agua. En mamíferos, inhibe la recaptación de monoaminas a través de la unión al transportador de dopamina, con un mecanismo de acción similar al de la cocaína, resultando en mayores niveles de dopamina en la sinapsis. La dopamina es un neurotransmisor catecolaminérgico involucrado en un amplio espectro de procesos, tales como locomoción, cognición, recompensa y trastornos mentales. Además, a nivel del eje hipotálamo-hipófisis la dopamina participa como un factor inhibidor en la secreción de prolactina (PRL) a través de su unión a los receptores tipo D2. En este trabajo hemos estudiado por primera vez los efectos neurotóxicos de TDF en embriones, larvas y adulto de pez cebra, así como su conexión con cambios en los sistemas dopaminérgicos y serotoninérgicos. Dado que la eclosión es usada en bioensayos para cuantificar el efecto de factores estresantes como TDF, comenzamos evaluando cómo la exposición crónica a TDF afecta la función secretora de las células de las glándulas de la eclosión (HGC) presentes en los embriones. La eclosión es el proceso por el cual el embrión emerge del huevo y en el pez cebra se produce a los 2 dpf (días post fertilización). Involucra la lisis del corion por la acción de las enzimas de la eclosión (HE), las cuales se secretan debido al efecto estimulante de la PRL. Observamos que el tratamiento con 35 mg/L de TDF comenzando a las 36 hpf produjo la retención de las enzimas en las HGC hasta los 4 dpf, un efecto que puede ser revertido por antagonistas de receptores tipo D2, pero no D1. Este resultado fue congruente con cambios en la expresión de prl. Además, el fenotipo dado por TDF en las HGC pudo ser reproducido usando mutantes para la enzima limitante de la velocidad de síntesis de catecolaminas, la tirosina hidroxilasa (TH1), sugiriendo que la dopamina se encuentra involucrada en la liberación de las HGC. Dadas las similitudes de TDF con la cocaína, también decidimos evaluar los efectos de este fungicida en el comportamiento. Evaluamos la exposición aguda de larvas de 5 dpf a diferentes concentraciones de TDF, que van desde los 5 mg/L a los 35 mg/L. La concentración más baja no alteró ni la actividad locomotora ni los niveles de dopamina, pero produjo una reducción en la serotonina extracelular y tuvo un efecto ansiolítico, respaldado por una disminución en la producción de cortisol. Por otro lado, un aumento en la concentración de TDF produjo una reducción dosis dependiente en la actividad locomotora, que podría revertirse o potenciarse por antagonistas de receptores de dopamina tipo D1 (SCH-23390) o D2 (haloperidol), respectivamente. Usando electroquímica in vivo, mostramos que 35 mg/L de TDF aumentan los niveles de dopamina en el cerebro, lo que es contradictorio ya que un aumento en la señalización dopaminérgica generalmente se relaciona con un incremento en la actividad motora, lo que sugiere que los efectos observados sobre la locomoción generados por TDF son probablemente debidos a otras vías, como la serotoninérgica. Para determinar cómo la dopamina afecta la actividad locomotora, utilizamos larvas de pez cebra genéticamente depletadas de dopamina, las cuales presentaron una actividad locomotora reducida, tal como se observa en mamíferos. Nuestros resultados obtenidos con larvas fueron radicalmente opuestos a los reportados con mamíferos adultos. Para determinar si se trataba de un efecto dependiente del desarrollo o de la especie, utilizamos pez cebra adultos. Observamos que la exposición a 5 mg/L de TDF aumenta la ansiedad y agresividad, mientras que 15 mg/L tiene un efecto estimulante sobre la locomoción, lo que coincide con las conductas observadas en mamíferos. Con estos resultados, también fue interesante determinar si TDF compartía otras similitudes con la cocaína, como la recompensa y adicción. La misma concentración que produjo un comportamiento ansioso se relacionó con el desarrollo de aversión condicionada de lugar (CPA), mientras que la exposición a niveles más altos de TDF promovió el desarrollo de preferencia condicionada de lugar (CPP). Estos resultados podrían explicarse teniendo en cuenta que 5 mg/L de TDF podrían estar disminuyendo los niveles de serotonina en la amígdala, lo que lleva a un comportamiento ansioso. De modo que la exposición constante a TDF produciría miedo condicionado y aversión al patrón relacionado con la droga. Por otro lado, 15 mg/L de TDF estarían aumentando la dopamina extracelular, la cual podría estimular el sistema de recompensa produciendo preferencia por el patrón asociado con TDF. En este trabajo mostramos los efectos conductuales y fisiológicos de TDF en larvas y peces cebra adultos, proporcionando evidencia de que los efectos son mediados a través de la perturbación en la actividad monoaminérgica. Proponemos que la dopamina es el principal neurotransmisor involucrado en la locomoción, la secreción de las HGC y el CPP ejercido por TDF, mientras que la serotonina se relacionaría con los comportamientos ansiosos, CPA y probablemente también con la locomoción.