Transmisión opiácea y alcoholismo : silenciamiento de la expresión del gen del receptor MU-opioide mediante RNA de interferencia

Abstract

El alcoholismo es un problema mundial de salud pública, por lo que es importante comprender sus bases neuro-farmacológicas para identificar nuevos blancos terapéuticos. Uno de los problemas del alcoholismo es la recaída, que corresponde a la pérdida de control sobre el consumo de alcohol cuando el paciente vuelve a beber después de un período de abstinencia. Estudios en modelos animales de alcoholismo han asociado un mayor valor placentero del alcohol al momento de la recaída. Este incremento del valor hedonístico del alcohol podría estar asociado a un mayor nivel del receptor (mu) μ-opioide (OPMR) en el circuito cerebral de recompensa. Para determinar el rol del OPMR en la recaída al consumo de alcohol, en este trabajo se presentan estudios destinados a evaluar la capacidad inhibitoria de distintas secuencias de RNAs de interferencia tipo horquilla (shRNAs) dirigidas a disminuir la expresión de OPMR in vitro, para ser utilizadas posteriormente en futuros estudios en modelos in vivo. Para ello se clonó el gen del receptor μ-opioide de rata (OPMRr) en el plásmido de expresión pHIV-GFP, generando pHIV-OPMRr-GFP. Se transfectaron células HEK-293T, que naturalmente no expresan OPMRr, con pHIV-OPMRr-GFP y se verificó la expresión de OPMRr mediante Western blot. Para lograr el silenciamiento de la expresión OPMRr se co-transfectó pHIV-OPMRr-GFP con cuatro secuencias distintas (A, B, C y D) de shRNAs dirigidos al RNA mensajero del OPMRr. Las secuencias A y D otorgaron el mayor grado de silenciamiento, inhibiendo en un 73% y 75% respectivamente la expresión de OPMRr. Se generaron lentivirus codificantes de los shRNAs más potentes en reducir su expresión para posteriores ensayos in vivo. En conclusión, mediante el uso de técnicas de biología molecular se clonó y expresó el gen del OPMRr en células en cultivo. Además, se identificaron 2 secuencias de shRNAs capaces de silenciar en más de un 70% la expresión del cDNA codificante para OPMRr y se generaron sus correspondientes lentivirus

Alcoholism is a worldwide public health problem. Therefore, it is important to understand its neuropharmacological bases to identify new therapeutic targets. One of the main problems of alcoholism is relapse, which is the loss of control over ethanol consumption when the patients start to drink again after a period of abstinence. Studies carried out on animal models of alcoholism have established an enhanced pleasurable value of ethanol consumption at the time of relapse. This alcohol enhanced hedonistic value could be associated to an increase in the μ-opioid receptor (OPMR) levels on the brain reward circuit. To determine the role of OPMR on ethanol consumption relapse, the ability of different short hairpin RNAs (shRNAs) to decrease OPMR expression in vitro was assessed. The best shRNAs are intended to be used in future in vivo studies. First, the rat μ-opioid receptor (OPMRr) gene was cloned into the expression plasmid pHIV-GFP, generating the pHIV-OPMRr-GFP plasmid. HEK-293T cells, which naturally do not express OPMRr, were transfected with pHIV-OPMRr-GFP and the OPMRr expression was determined by Western blot. To assess the silencing of the OPMRr in vitro, the pHIV-OPMRr-GFP plasmid was co-transfected with 4 shRNAs sequences (A, B, C y D) designed against the OPMRr messenger RNA. shRNAs A and D exhibit the highest silencing ability, inhibiting OPMRr expression by 73% and 75% respectively. For future in vivo assays, lentiviral vectors codifying for these shRNAs were generated. In conclusion, using molecular biology techniques it was possible to clone and express the gene of the OPMRr in HEK-293T cells. Two shRNAs sequences that inhibit the OPMRr cDNA expression over a 70% were identified and lentiviral vectors that codify for these shRNAs were generated