Estudio comparado del desarrollo de asimetría cerebral en el epitálamo de pez cebra (Danio rerio) y pez medaka (Oryzias latipes)

Abstract

Las asimetrías cerebrales en el eje izquierda-derecha de vertebrados poseen componentes altamente conservados y son un punto importante de estudio para la biología del desarrollo. Entre estas asimetrías, las más estudiadas se encuentran en el epitálamo, una región ubicada en el diencéfalo dorsal de vertebrados cuyas conspicuas asimetrías poseen un importante factor hereditario y de lateralidad. En esta región, se encuentra la presencia de un par de núcleos habenulares (Hb, órgano par), además se encuentra el complejo pineal formado por el órgano pineal (órgano impar) en la línea media y por el órgano parapineal (Opp) que se encuentra a la izquierda y proyecta axones eferentes hacia la habénula ipsilateral. En este trabajo se realizó un estudio comparado entre dos especies de teleósteos, pez cebra (D. rerio) y pez medaka (O. latipes), para intentar dilucidar como se generan las características conservadas y especie-específicas durante la ontogenia del epitálamo. Estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que estos teleósteos poseen variaciones morfotopológicas especie-específicas en la región del epitálamo (heterotopías) y, luego de normalizar los tiempos de desarrollo en ambas especies, se comprobó que también existen variaciones en la temporalidad del desarrollo (heterocronías). La heterocronía más significativa es que las proyecciones Opp de pez medaka se desarrollan antes que en pez cebra. Debido a lo anterior, se puede hipotetizar que las diferencias topológicas observadas entre ambas especies podrían tener relación con la temporalidad de desarrollo de los componentes que forman el circuito Opp-Hb. En este contexto, el momento en que ocurre la interacción entre el Opp y la Hb podría ser un factor importante para definir la citoarquitectura final del circuito. Lo anterior se respalda en el hecho de que en pez cebra las células habenulares tienen distinta temporalidad de proliferación en cada núcleo, lo que genera subnúcleos habenulares lateral y medial, de distintos tamaños. Este rasgo asimétrico sería dependiente de la presencia del órgano parapineal, ya que a cada subnúcleo se han asociado marcadores moleculares cuya expresión suele ser asimétrica, pero ésta se pierde cuando el Opp es ablacionado. Por otra parte, la neurogénesis habenular, posee asimetría izquierda en su inicio, la cual se conserva incluso luego de ablacionar el Opp, lo que la define como un rasgo asimétrico independiente de la presencia del Opp. Luego, si suponemos que estas interacciones son conservadas también en el modelo de pez medaka, las eventuales variaciones heterocrónicas pueden estudiarse para comprender como podrían generarse las diferencias topológicas entre ambos teleósteos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue dilucidar si estas características se encuentran conservadas y observar de qué manera podría influir el adelantamiento de las proyecciones del Opp. Se esperaba que la neurogénesis habenular de pez medaka inicie de manera asimétrica en el mismo momento de desarrollo que pez cebra. Por otro lado, se esperaba que la proliferación celular, al ser un evento dependiente del Opp, se inicie antes debido al adelantamiento de la ontogenia del Opp. Para estudiar lo anterior se utilizó el marcador pan neuronal HuC, para identificar neuronas diferenciadas y se usaron marcadores moleculares que en pez cebra se asocian al dominio de los subnúcleos habenulares. Los resultados de nuestro estudio demostraron nueva evidencia de heterotopía y heterocronía entre pez cebra y medaka, se descartó la hipótesis planteada, pues la neurogénesis habenular en pez medaka está adelantada pero continúa siendo asimétrica en su inicio, lo que podría indicar que en esta especie sí existe una relación entre el Opp y la neurogénesis habenular. Por otro lado, con el gen nptx2a, ortólogo de narp de pez cebra, se encontró un arreglo topológico diferente a la asimetría izquierda esperada con narp, pues el marcador de pez medaka es más simétrico y se limita a una región más pequeña en ambas habénulas, asemejándose más a una topología propia a la descrita en la habénula derecha de pez cebra. Nuestros estudios respaldan la idea de que las interacciones entre el Opp y la HbI parecen ser más complejas de lo que los estudios en pez cebra revelan. Nuestros resultados sugieren interacciones más tempranas y probablemente bidireccional entre la habénula izquierda y el órgano parapineal

Brain asymmetries along the left-right axis show highly conserved components across vertebrates. Among these asymmetries the most studied is found in the epithalamus, a region located in the dorsal diencephalon. Epithalamic asymmetries are conspicuous and genetically controlled, and are characterised by the presence of left-right differences in morphology and gene expression of the bilaterally paired habenular nuclei and by the left-sided asymmetric position and connectivity to the left habenula (Hb) of the unpaired parapineal organ (PpO), an accesory component of the pineal complex. In this work we performed a comparative study between two species of teleosts, zebrafish (D. rerio) and medaka (O. latipes), to elucidate how the conserved and species-specific features of epithalamic asymmetries are generated during the ontogeny of the epithalamus. Previous studies of our laboratory showed that these teleosts show both topological and temporal variations in the development of epithalamic asymmetries, known as heterotopies and heterochronies, respectively. Among the latter, the most significant difference is observed in the timing of connectivity of the parapineal organ to the left Hb, which in medaka fish begins earlier than in zebrafish. Due to the above, we hypothesised that the topological differences observed between both species could be related to the temporality of development of the components that make up the parapineal-habenula circuit. In this context, the time in which the interaction between the parapineal organ and the habenula occurs could be an important factor in defining the final cytoarchitecture of the circuit. This idea is supported by the fact that in zebrafish the habenular cells have different temporality of proliferation in the left and right nuclei, which generates size differences in the lateral and medial habenular subnuclei on both sides. This asymmetric trait appears to depend on the presence of the parapineal organ, since the asymmetric expression of the molecular markers that have been associated to each habenular sub-nuclei is lost when the parapineal organ is physically removed during development. In contrast, the onset of habenular neurogenesis is asymmetric even after ablating the PpO, which defines a type of asymmetry that is independent of the parapineal organ. Based on the above and if we assume that these types of asymmetries are also conserved in medaka, the heterochronic variations can be studied as a possible factor that explains how the topological differences of epithalamic asymmetry between both teleosts are generated. Therefore, the aim of this work was to have a first mechanistic approach to this question and investigate the timing and organisation of habenular neurogenesis in medaka and relate this to the pattern observed in zebrafish and the advancement of parapineal projections in both species. Habenular neurogenesis of medaka was expected to start asymmetrically at the same time as in zebrafish while cell proliferation, being an event dependent of the parapineal organ, it was expected to start earlier due to overtaking of parapineal projections in this species. The pan-neuronal marker HuC was used to identify differentiated neurons and molecular subnuclei. The results of this study provided new evidence of heterotopic and heterochronic shifts between zebrafish and medaka that appear to rule out our hypothesis. The onset of habenular neurogenesis in medaka was asymmetric as in zebrafish but appeared at an earlier stage. This observation suggest that in contrast to zebrafish, the onset of asymmetric habenular neurogenesis in medaka has some type of dependency on the parapineal organ. This possibility can be assesed in the future by performing parapineal ablation in medaka. On the other hand, using the medaka nptx2a gene, an ortholog of zebrafish narp, we observed a different topological arrangement with a more restricted and fairly symmetric habenular expression, in contrast to the broad and pronounced left-sided asymmetric expression observed in zebrafish. This expression pattern resembles the topology described in the right habenula of zebrafish. In summary, our studies support the idea that interactions between the parapineal organ and the left Hb are more complex than the studies of zebrafish suggest. These interactions appear to have an earlier onset and show a bi-directional nature