Transformación estable de Solanum lycoperscum y Nicotiana tabacum con los genes de las proteínas dulces Taumatina y Brazeina

Abstract

Las proteínas dulces Taumatina (Tau) y Brazeina (Bra), son proteínas no tóxicas, las cuales son 2.000 a 3.000 veces más dulces que la sacarosa y 10 veces más dulces que la Stevia, pero con la ventaja de tener un sabor similar a la sacarosa. En la actualidad, se han utilizado como edulcorantes y potenciadores naturales del sabor en diferentes alimentos. Al igual que la Stevia, no aporta calorías y es un alimento apto para diabéticos. Por estas razones, la expresión de Tau y Bra, podría ser una estrategia útil para mejorar el sabor de frutos, haciéndolos más dulces, sin añadir calorías y carbohidratos. Además, también se ha descrito que estas proteínas son similares a proteínas con actividad anti patógenos (taumatina) o a péptidos antimicrobianos (brazeina) en plantas, lo que las hace también atractivas para ésta aplicación biotecnológica. En el contexto de este trabajo y con el fin de expresar los genes tau y bra en frutos, se generaron los vectores pPG-taubra, pPG-tau, pPG-bra, 35SCaMV-tau y 35SCaMV-bra, tres con promotor fruto específico y dos con promotor constitutivo. En la presente memoria de título, se analizó la funcionalidad de los vectores a través de la transformación transitoria de frutos de tomate y hojas de tabaco. Se obtuvo que 4 de los 5 vectores son funcionales para expresar el transgen. Luego, se prosiguió con la transformación estable de tomate y tabaco, con dichos vectores de expresión. Durante esta memoria de título, se estandarizó con éxito la transformación de tomate usando hojas como explantes y se comparó con la transformación estable a partir de explantes de cotiledón. La correcta transformación y expresión de los transgenes tau y bra fue evaluada por PCR y RT-PCR, respectivamente en líneas de tomate y tabaco, se obtuvo 5 y 2 líneas de tomate transgénicas (por PCR) para taubra y bra, respectivamente. En tabaco se obtuvo 4 líneas transgénicas que expresan el transgen tau y 4 líneas transgénicas que expresan bra

The sweet proteins Thaumatin (Tau) and Brazzein (Bra), are non-toxic proteins, of 2,000 to 3,000 fold sweeter than sucrose and 10 times sweeter than stevia but with the advantage of having a more similar flavor to sucrose. At present, they have been used as sweeteners and natural flavor enhancers in different foods. As proteins they do not provide calories and are suitable for diabetics. For these reasons, the expression of Tau and Bra could be a useful strategy to improve fruit flavor, making it sweeter, without adding calories and carbohydrates. In addition, these proteins are similar to proteins with anti-pathogenic activity (thaumatin) or antimicrobial peptides (brazeine) in plants, which makes them also attractive for biotechnological applications in this field. In the context of this work and in order to express the tau and bra genes, they were generated five expression vectors for these proteins, pPG-taubra, pPG-tau, pPG-bra, 35SCaMV-tau and 35SCaMV-bra, were generated. Three of them with a fruit specific promoter and two with a constitutive promoter. In the present thesis, the functionality of these vectors was achieved through the transient transformation of tomato fruits and tobacco leaves. We obtained that four of the five vectors were functional permitting the expression of the transgene. Then, the stable transformation of tomato and tobacco was carried out to express the transgenes in fruits and leaves, respectively. During this thesis, tomato transformation using leaves as explants was successfully standardized and compared with stable transformation from cotyledon explants. The correct transformation and expression of the tau and bra transgenes was evaluated by PCR and RT-PCR, respectively. In conclusion five and two transgenic tomato plants for the fusion protein taubra and bra were obtained (by PCR). Also, four transgenic tobacco lines each, for tau and bra which express the transgene (by RT-PCR), were obtained