Generación de la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1 como herramienta para la futura identificación de proteínas que interaccionan con la endonucleasa apurínica/apirimidínica TcAP1 de Trypanosoma cruzi

Abstract

El agente etiológico de la enfermedad de Chagas es el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad posee un carácter endémico en América Latina y se estima un promedio de 8 millones de personas infectadas. El ciclo de vida de T. cruzi involucra insectos vectores y mamíferos hospederos, en los cuales se diferencia en tres formas celulares finales: epimastigote (extracelular y replicativa) presente en los vectores triatominos; tripomastigote (extracelular no replicativa e infectiva) que se encuentra tanto en insectos vectores como en hospederos mamíferos; y amastigote (intracelular y replicativa) presente en hospederos mamíferos. En ambos hospederos, T. cruzi se encuentra sometido a la acción de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS/RNS) que dañan su DNA. No obstante, el parásito sobrevive a la acción del estrés oxidativo. En la mayoría de los eucariontes, el daño oxidativo al DNA es reparado principalmente por la vía de reparación por escisión de bases (BER), proceso conservado en el que participan una serie de proteínas con actividad enzimática, siendo fundamentales las endonucleasas apurínicas/apirimidínicas (endonucleasas AP). En el genoma de T. cruzi se identificó la secuencia de la endonucleasa AP TcAP1, homóloga al endonucleasa AP de humano (APE1). Se demostró que la sobrexpresión de esta enzima incrementa la viabilidad de epimastigotes y tripomastigotes expuestos a ROS/RNS y que la inhibición de la actividad de TcAP1 genera el efecto opuesto; es decir, disminuye la viabilidad de los parásitos tratados con agentes oxidantes. Actualmente, se sabe que APE1 humana se relaciona directamente con otras enzimas de la vía BER y modula la expresión de proteínas que participan de otras vías de reparación del DNA. Hasta el momento no se ha determinado si TcAP1 se asocia a otras proteínas, como ocurre con su ortóloga APE1 en humanos. En esta memoria de título se propuso generar herramientas que permitan a futuro identificar las proteínas parasitarias asociadas a la endonucleasa TcAP1 de T. cruzi, las cuales podrían modular o ser moduladas por ella. Para tales efectos, se diseñaron dos construcciones plasmidiales (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 y pTREX-cmyc-tcap1) con el objetivo de generar proteínas de fusión de TcAP1 asociadas a diferentes epítopes ((HA)3-(FLAG)3 o c-Myc). Estos vectores de expresión se transfectaron en XIepimastigotes de la cepa Y de T. cruzi, los que se seleccionaron con el antibiótico G-418. Solo se obtuvieron epimastigotes transfectantes que expresaron la proteína de fusión N-cMyc-TcAP1, evidenciado mediante ensayos de Western blot. Utilizando un kit comercial (anti-cMyc), se realizaron ensayos de inmunoprecipitación sobre homogeneizados de proteínas totales obtenidas desde los epimastigotes transfectantes que expresan N-cMyc-TcAP1 y epimastigotes control no transfectados. Las proteínas obtenidas se separaron mediante electroforesis bidimensional en condiciones desnaturantes con el objetivo de evidenciar patrones electroforéticos diferenciales entre parásitos transfectantes y controles. Las proteínas detectadas de manera exclusiva para los parásitos transfectantes se enviaron a identificar mediante espectrometría de masa, sin embargo, no se obtuvieron resultados concluyentes. A pesar de los problemas presentados, esta memoria de título presenta una gran relevancia para nuestro laboratorio, ya que permitió generar herramientas para la futura identificación de proteínas reguladoras de la actividad de TcAP1 o que son reguladas por ella

The etiologic agent of Chagas disease is the hemoflagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi). This disease is endemic in Latin America and an estimated 8 million people are infected. The life cycle of T. cruzi involves triatomine insect vectors and mammalian hosts, in which it differs in three final cellular forms: epimastigote (extracellular and replicative) present in triatomine vectors; trypomastigote (non-replicative and infective extracellular form) found in both, insect vectors and mammalian hosts; and amastigote (intracellular and replicative) present in mammalian hosts only. Inside both hosts, T. cruzi is exposed to reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) that damage the parasite DNA, however the parasite survives. In most eukaryotes, oxidative DNA damage is repaired mainly by the base excision repair pathway (BER), a conserved mechanism, in which a series of proteins with enzymatic activity participate, being apurinic/apyrimidinic endonucleases (AP endonuclease) essential to this process. In the T. cruzi genome the nucleotide coding sequence for an AP endonuclease (TcAP1), homologous to human AP endonuclease (APE1), was identified. In previous reports it has been demonstrated that the overexpression of this enzyme in T. cruzi, increases the viability of epimastigotes and trypomastigotes exposed to ROS/RNS and that the inhibition of TcAP1 activity generates the opposite effect, decreasing the parasite viability. Currently, human APE1 is known to directly interact with other enzymes of the BER pathway and modulates the expression of proteins involved in other DNA repair pathways. To date, it has not been determined whether T. cruzi TcAP1 is associated with other proteins, similar to those reported for APE1 ortholog human protein. In this work, it was proposed to generate tools that allow the future identification of parasitic proteins that interacts with the TcAP1 endonuclease, which could modulate their activity or or proteins that modulate their activity product of its interaction with TcAP1. For this purpose, two plasmid constructs (pTREX-(ha)3-(flag)3-tcap1 and XIIIpTREX-cmyc-tcap1) were designed with the aim of generating TcAP1 fusion proteins associated with different tags ((HA)3-(FLAG)3 or c-Myc). These expression vectors were transfected into epimastigotes of the T. cruzi Y strain, which were selected with the G-418 antibiotic. Only transfectant epimastigotes expressing the N-cMyc-TcAP1 fusion protein, evidenced by Western blot assays, were obtained. Using a commercial kit (anti-cMyc), immunoprecipitation assays were performed on total protein homogenates obtained from transfectant epimastigotes expressing N-cMyc-TcAP1 and untransfected control epimastigotes. The proteins obtained were separated by two-dimensional electrophoresis under denaturing conditions with the aim of evidencing differential electrophoretic patterns between transfectant and control parasites. The proteins exclusively detected for the transfectant parasites were sent to be identified by mass spectrometry. However, these could not be identified. Despite the presented problems, this title memory presents a great relevance for our laboratory, since it allowed to generate tools for the future identification of proteins that interacts with the TcAP1 enzyme