Determinación del mecanismo mecano-químico de la proteína bip en el proceso de translocación in multiplo

Abstract

Translocación post-traduccional de proteínas a través del retículo endoplasmático es mediado por una proteína canal denominado complejo Sec61 y una proteína motor auxiliar llamada BiP (por Immunoglobulin Binding Protein). BiP es una proteína miembro de la familia de chaperonas Hsp70 (Heat Shock Protein 70). Por otra parte se ha planteado que es un motor molecular, ya que es una ATPasa y se ha sugerido que se encuentra involucrado en la aplicación de fuerza durante el proceso post-traduccional de translocación de proteínas. La fuerza ejercida por BiP no ha sido completamente dilucidada y hay estudios que sugieren que BiP podría estar involucrada en un mecanismo pasivo de rectificación del movimiento o del inglés ratchet y/o posiblemente en un mecanismo activo de tiraje directo o del inglés power stroke. Una forma directa de poder dilucidar este mecanismo, es mediante una técnica denominada “pinzas ópticas” que permiten la medición de fuerzas en biomoléculas. Este instrumento ha sido usado por nuestro laboratorio para intentar medir fuerzas en el proceso de translocación, sin embargo, esta estrategia experimental en nuestro sistema de translocación, ha presentado dos principales dificultades. Para poder mantener el complejo Sec61 solubilizado se requiere de un detergente el cual genera micelas que dificultan la medición, al interferir con el láser del instrumento (observación experimental de nuestro laboratorio). Además la velocidad de translocación es muy lenta para el sistema de pinzas ópticas (1,1 aminoácidos por segundo), por lo cual compite con el ruido instrumental. Por lo tanto, en este trabajo se propuso utilizar un nuevo método para poder determinar el mecanismo mecano-químico de BiP en el proceso de translocación post-traduccional. Este consistió en utilizar ensayos de translocación in vitro y medir las fuerzas generadas por BiP in multiplo (es decir, in vitro de muchas moléculas a la vez), utilizando proteínas sustratos que se despliegan a diferentes fuerzas (cuyas fuerzas de desplegamiento han sido determinadas por pinzas ópticas o por AFM). Se usaron diferentes construcciones para realizar ensayos de translocación, la construcción de la proteína quimérica de Titina usado como control positivo demostró ser translocada en el ensayo de protección en microsomas obteniéndose un 31% de translocación. Posteriormente, el control negativo de la construcción de la proteína quimérica de Top7 demostró no ser translocada debido a la alta fuerza de desplegamiento que posee esta proteína escapando de los niveles de fuerza que podría generar un motor molecular de power stroke. Por último, la proteína quimera de CaM demostró tampoco ser translocada sugiriendo de esta forma que la proteína BiP estaría actuando como un motor molecular de tipo ratchet en translocación post-traduccional de proteínas

Post-translational protein translocation through the endoplasmic reticulum is mediated by a channel protein called Sec61 complex and an auxiliary motor protein called BiP (by Immunoglobulin Binding Protein). BiP is a protein member of the Hsp70 chaperone family (Heat Shock Protein 70). On the other hand, it´s been proposed that it´s a molecular motor, since BiP is an ATPase and it´s been suggested that this protein is involved in the application of force during the post-translational process of protein translocation. The force exerted by BiP has not been completely elucidated and studies suggest that BiP could be involved in a passive rectification mechanism of the movement or ratchet and / or possibly in an active mechanism of direct pull or English power stroke. A direct way to elucidate this mechanism is by a technique called "optical tweezers" that allows the measurement of forces in biomolecules. This instrument has been used by our laboratory to try to measure forces in the translocation process, however this experimental strategy in our translocation system has presented two main difficulties; In order to maintain the Sec61 complex solubilized, a detergent is required, which generates micelles that make measurement difficult, by interfering with the laser of the instrument (experimental observation of our laboratory). In addition, the speed of translocation is very slow for the system of optical tweezers (1.1 amino acids per second), which competes with the instrumental noise. Therefore, in this work we propose to use a new method to determine the mechanochemical mechanism of BiP in the post-translational translocation process. This consists of using in vitro translocation assays and measuring the forces generated by BiP in multiplo (is to say, in vitro of many molecules at the same time), using protein substrates that are deployed at different forces (whose unfolding forces have been determined by optical tweezers or by AFM). Different constructs were used to perform translocation assays, the titin chimera protein construct used as a positive control proved to be translocated in the protection test in microsomes obtaining a 31% translocation. Subsequently, the negative control of the Top7 chimera protein construct proved not to be translocated due to the high unfolding force that this protein has, escaping from the levels of force that a molecular power-stroke engine could generate. Finally, the CaM chimera protein also showed not to be translocated, thus suggesting that the BiP protein would act as a ratchet-type molecular motor engine in post-translational protein translocation