Desarrollo de un vector viral para la edición génica mediante CRISPR/Cas9 en Vitis vinifera

Abstract

La edición génica es una disciplina emergente que busca desarrollar estrategias y métodos para la modificación eficiente y específica del DNA en las células vivas. En plantas, la edición génica posee un gran potencial para la investigación básica y aplicada, permitiendo el estudio de genes, como también el mejoramiento de cultivos. Las técnicas de edición génica actuales se basan especialmente en nucleasas sitio-específicas (NSE) como el sistema CRISPR/Cas9 (del inglés, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated protein 9), que crea cortes de doble hebra (DSBs, del inglés double strand breaks) sitiodirigidos en el genoma. El sistema CRISPR/Cas9 está compuesto por la endonucleasa Cas9 y un RNA sintético llamado RNA guía (gRNA), que es complementario a una secuencia específica del genoma. Los gRNA y Cas9 forman un complejo, permitiendo el reconocimiento y corte del DNA blanco. Estos cortes se reparan con mayor frecuencia mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining), que tiene una alta propensión a inducir mutaciones por inserción o deleción (indels) en el sitio de corte que pueden inactivar la función de un gen. El reconocimiento del sitio de corte en el DNA también es dependiente de la presencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), cuya secuencia consenso es NGG. En Vitis vinifera, los niveles de expresión de los componentes de CRISPR/Cas9 en el núcleo celular presentan una barrera para lograr mutaciones eficientemente en el genoma. Con el objetivo de mejorar este sistema, desarrollamos un vector basado en replicones de DNA derivados del virus del enanismo del poroto amarillo para la expresión de Cas9 y los gRNA. Utilizando este vector, pudimos generar una deleción de 1.428 pb en la secuencia genómica del gen VvSWEET4 en embriones somáticos de vides transformados con Rizhobium radiobacter. Nuestros resultados también mostraron un aumento de cuatro veces en la eficiencia de edición del gen blanco, en comparación a la edición mediada por un vector T-DNA clásico. La estrategia propuesta hace posible la creación de modificaciones precisas del genoma de la vid sin la necesidad de una integración estable de los componentes del sistema CRISPR/Cas9

Genome engineering is a rapidly emerging discipline that aims to develop strategies and methods for efficient and targeted DNA modifications in living cells. In plant sciences, gene editing has enormous potential for basic and applied research allowing for both the study of individual genes and crop improvement. Current genetic engineering techniques are mostly based on sequence-specific nucleases (SSNs), such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9. The CRISPR/Cas9 system is composed by a Cas9 endonuclease and a synthetic guide RNA (gRNA) complementary to a specific target sequence producing a DNA double-strand break (DSB) in the genome. These breaks are most frequently repaired by non-homologous DNA end joining (NHEJ) manner, which has a high tendency to induce insertion/deletion (indels) mutations at the break site that knock-out gene function. gRNAs can be designed and led to form editing complexes with Cas9 under in vivo conditions generating indels and eventually loss of function mutations. Additionally, the presence of a NGG sequence called Protospacer Adjacent Motif (PAM) in the target genome is a strict requisite for the generation of the DSB. In Vitis vinifera, delivery of CRISPR/Cas9 reagents presents a barrier to efficiently achieve targeted genome modifications. To improve that efficiency, we developed a vector based on DNA replicons derived from the geminivirus Bean Yellow Dwarf Virus (BeYDV) for the expression of Cas9 and gRNAs. Using this vector, a 1428 bp deletion in the genomic sequence of the VvSWEET4 gene was carried out using a Rizhobium radiobacter-mediated transformation of grapevine somatic embryos. Our results also showed a four-fold increase in the editing efficiency of the target gene, compared to a T-DNA based vector. The proposed strategy makes possible the establishment of precise modifications in the grapevine genome without need of stable integration of the sequences encoding for the CRISPR/Cas9 components