Caracterización funcional de los factores de transcripción DcAlfin4 y DcAlfin7 de Daucus carota (zanahoria) y su aplicación biotecnológica

Abstract

El cambio climático (CC) caracterizado por alzas de temperatura, desertificación y aumento de salinidad, entre otros, genera en plantas estrés abiótico (EA) lo que conlleva a una reducción en la tasa de producción de plantas comerciales afectando a la economía de los países. Este es el caso del Kiwi (Actinidea deliciosa), el cual se encuentra dentro de las cinco frutas más exportadas por nuestro país, posicionando a Chile como es el segundo mayor exportador de kiwi del hemisferio sur y el tercero a nivel mundial. Uno de los mayores problemas en el cultivo de kiwi, es su sensibilidad a suelos salinos y a la falta de riego, lo que disminuye el calibre de los frutos y limita la distribución geográfica de los campos de kiwi. Lo anterior, y teniendo en consideración los efectos del CC, plantea a la generación de nuevas variedades de patrones de kiwi con mayor tolerancia a EA como un desafío biotecnológico. Los factores de transcripción (FT) son reguladores clave del metabolismo vegetal y de diversos procesos fisiológicos, incluyendo la respuesta a los estímulos ambientales como el frío, salinidad y sequía. Dentro de los FT involucrados en la respuesta a EA, destaca la familia ALFIN, algunos de ellos caracterizados en Medicago sativa (Alfalfa), Arabidopsis thaliana y Glycine max (soja). Previamente, en nuestro grupo identificamos y determinamos que los genes DcAlfin4 y DcAlfin7 de D. carota codifican para proteínas con: (i) localización nuclear, (ii) capacidad de transactivar la transcripción y (iii) capacidad de unirse a elementos cis en el promotor del gen DcPsy2. Este gen, codifica para una enzima clave en la biosíntesis de carotenoides, compuestos antioxidantes y precursores de la hormona acido abscísico (ABA) involucrada en la tolerancia a EA. En el presente trabajo, se determinó que los genes DcAlfin4 y DcAlfin7 aumentan su nivel transcripcional al someter plantas de D. carota a tratamientos agudos con NaCl. Por ello, se determinó si los genes DcAlfin4 y DcAlfin7 conferían tolerancia a estrés abiótico usando un sistema modelo como lo es Arabidopsis thaliana. Las líneas transgénicas homocigotas de A. thaliana que expresan DcAlfin4 presentaron una inducción en la expresión de AtPsy, mayores niveles de carotenoides totales y de clorofila a y b, junto con una mayor tasa de supervivencia y menor reducción de biomasa en tratamientos crónicos de salinidad y sequía respecto a las plantas de control. Líneas transgénicas homocigotas de A. thaliana que expresan DcAlfin7 presentaron una mayor tasa de supervivencia en tratamiento crónico de salinidad, pero tanto su peso fresco como biomasa se vieron reducidos en tratamientos de estrés salino e hídrico. Además, las líneas de A.thaliana transgénicas para DcAlfin7 no mostraron una correlación entre el aumento en carotenoides y la expresión de AtPsy. Lo que sugiere que el mecanismo de ambos FTs es diferente en el rol de conferir de tolerancia a salinidad y sequía en A. thaliana, en donde es la expresión del gen DcAlfin4 la que genera un mayor aumento en la tolerancia a estrés salino e hídrico.Por otro lado, líneas de A. deliciosa que expresa DcAlfin4 y DcAlfin7 presentaron un mayor contenido de carotenoides y de clorofilas. Además, hojas de líneas transgénicas DcAlfin4 y DcAlfin7 mostraron un estado oxidativo basal menor en comparación a hojas de plantas no transgénicas. Si bien se debe determinar la tolerancia a salinidad y sequía en plantas de kiwi, los resultados obtenidos nos permiten proponer a los genes DcAlfin4 (y DcAlfin7 en menor medida) como herramientas biotecnológicas para el mejoramiento genético de cultivos de importancia comercial para el país.

Climate change (CC), characterized by temperature rises, desertification and increased salinity, among others, generates abiotic stress (AS) in plants which leads to a reduction in the yield of commercial plants affecting the economies of countries. This is the case of the kiwi (Actinidea deliciosa), which is one of the five most exported fruits of our country, positioning Chile as the second largest exporter of kiwi in the southern hemisphere and the third worldwide. One of the biggest problems in the cultivation of kiwi is its sensitivity to saline soils and lack of irrigation, which decreases the size of the fruit and limits the geographical distribution of kiwi plantations. Considering the effects of CC means that the generation of new varieties of kiwi with higher tolerance to abiotic stress is a biotechnological challenge. Transcription factors (TF) are key regulators of plant metabolism and various physiological processes, including the response to environmental stimuli such as cold, salinity and drought. Multiple TFs regulate the expression of stress-inducible genes, which are involved in acclimation and tolerance to AS conditions. Within the TFs involved in the response to AS, the ALFIN stands out. Previously, in our group it has been identified and demonstrated that DcAlfin4 and DcAlfin7 genes from Daucus carota (carrot) encode for proteins with: (i) nuclear localization, (ii) ability to transactivate transcription and (iii) ability to bind to cis elements in the promoter of the DcPsy2 gene. This gene encode for a key enzyme involved in the biosynthesis of carotenoids, antioxidant compounds and precursors of abscisic acid (ABA) hormone involved in the response to AS. In the present work, it was determined that the genes DcAlfin4 and DcAlfin7 increase their transcriptional levels in plants of D. carota under treatments with NaCl. Therefore, the ability of DcAlfin4 and DcAlfin7 genes to confer AS tolerance in a model system such as Arabidopsis thaliana, was evaluated. Homozygous transgenic lines of A. thaliana that expressed DcAlfin4 showed an induction in the expression of AtPsy, higher levels of total carotenoids and chlorophyll a and b, together with a higher survival rate and lower biomass reduction in chronic salinity and drought treatments with respect to the control plants. Transgenic homozygous lines of A.thaliana expressing DcAlfin7 showed a higher survival rate in chronic treatments of salinity, but a decrease in the fresh weight and biomass compared to control plants without showing a correlation with the increase in carotenoids and the expression of AtPsy. This suggests that the mechanism of both TFs are different in the role of conferring tolerance to salinity and drought in A. thaliana, being the expression of the gene DcAlfin4 which generates a higher increase in tolerance to saline and hydric stress. Moreover, lines of A. deliciosa expressing DcAlfin4 and DcAlfin7 presented a higher content of carotenoids and chlorophylls. In addition, leaves of transgenic kiwi lines for DcAlfin4 and DcAlfin7 showed a lower state of basal oxidation compared to leaves of non-transgenic plants. Although the tolerance to salinity and drought in kiwifruit plants has yet to be determined, the results obtained allow us to propose that DcAlfin4 (and DcAlfin7 in lesser extent) are useful biotechnological tools for the genetic improvement of crops of commercial importance for the country.