Efecto de la co-infección de echinococcus granulosus y fasciola hepática en la fertilidad del quiste hidatídico y en la respuesta inmune local de tipo celular

Abstract

La co-ocurrencia de parásitos o “poliparasitismo” en un mismo hospedero es un he-cho bien documentado en la literatura médica, veterinaria y zoológica. La mayoría de los animales que existen en la naturaleza y humanos que viven en zonas rurales, albergan varias especies de parásitos de forma concurrente. Los helmintos parásitos son un grupo muy diverso de organismos que poseen diferentes aspectos morfológi-cos y moleculares, además de adoptar distintos estados de desarrollo durante su ciclo de vida. Dentro de sus hospederos, los helmintos recurren a diferentes estrate-gias para sobrevivir, ya sea migrando por diferentes órganos durante sus estadios de desarrollo o permaneciendo en un mismo nicho. Estas diferentes estrategias de vida están asociadas a la respuesta inmune que gatillan en su hospedero. Las interaccio-nes entre parásitos diferentes cuando modulan el sistema inmune de un mismo hos-pedero pueden ser sinérgicas o antagónicas dependiendo del tipo de respuesta in-mune que se genera contra cada especie de parásito. El tipo de respuesta inmune general que ocurre contra helmintos parásitos se cataloga como “Th2-like”. Se carac-teriza por tener altos niveles de citoquinas propias del perfil Th2 sumada a la prolife-ración de linfocitos T reguladores, macrófagos activados de forma alternativa y se-creción de IL-10 y TGF-β. A pesar de ser una respuesta muy eficiente para contener al parásito, rara vez es capaz de eliminar completamente la infección. En Chile, existen dos especies de helmintos zoonóticos que frecuentemente co-habitan un mismo hospedero rumiante: Echinococcus granulosus y Fasciola hepati-ca. Ambos parásitos se alojan en el hígado de su hospedero, sin embargo, Echino-coccus granulosus es capaz de diseminarse por todo el organismo, siendo el pulmón la segunda víscera donde se aloja con mayor frecuencia. Son causa de graves en-fermedades en el ser humano y de importantes pérdidas económicas en animales productivos. La respuesta inmune que ambos parásitos son capaces de gatillar es similar. Así, en ensayos de inmunización en modelos animales, sueros obtenidos desde animales inmunizados con antígenos provenientes de parásitos del género Fasciola reconocen diversas proteínas obtenidas desde lisados de protoescólices de Echinococcus granulosus. Del mismo modo, sueros obtenidos desde animales inmu-nizados con antígenos provenientes de Echinococcus granulosus identifican proteí-nas de parásitos del género Fasciola, lo que permite postular que la co-infección de un mismo individuo con ambos parásitos debería presentar una interacción sinérgica. Contrario a ello, la presencia de Fasciola hepatica se asocia a cambios en la fre-cuencia de presentación de quistes hidatídicos de Echinococcus granulosus en los animales que presentan co-infección; la cantidad de quistes hidatídicos alojados en hígado es menor y los que se encuentran en pulmones son más pequeños y presen-tan un pobre desarrollo. Dado que las interacciones que ocurren entre dos parásitos están íntimamente rela-cionadas a la especie del hospedero que las alberga, en este trabajo se investigaron tres aspectos fundamentales: la respuesta inmune que ocurre en bovinos y ovinos sobre el metacestodo y su relación sobre la fertilidad de los quistes hidatídicos; la variabilidad intraespecífica de Echinococcus granulosus en bovinos y ovinos y su relación con aspectos biológicos como el tamaño de los quistes o la respuesta inmu-ne presente en la capa adventicia y por último, si la co-infección con Fasciola hepati-ca influye en el desarrollo de los quistes hidatídicos en bovinos y ovinos. Se realizaron visitas a diferentes plantas faenadoras del país para obtener quistes hidatídicos desde vísceras decomisadas de bovinos y ovinos. En cada caso, se reco-lectaron todos los quistes hidatídicos en la víscera afectada y se registró si el animal estaba concomitantemente infectado con Fasciola hepatica. Cada muestra fue medi-da y se tomaron muestras de DNA y de la pared del quiste para procesamiento histo-lógico. En el presente trabajo se recolectaron 418 quistes hidatídicos en total, prove-nientes de 82 bovinos y 117 ovinos. En ovinos, no hubo casos de poliparasitismo con Fasciola hepatica, mientras que en bovinos, el 20% de las muestras de Echinococ-cus granulosus presentaron la presencia de Fasciola hepatica de forma concomitan-te. Los efectos del poliparasitismo se evaluaron sólo en bovinos, mientras que en ovinos se evaluaron las diferencias de capa adventicia y haplotipos entre quistes hi-datídicos fértiles e infértiles. Respecto a la respuesta inmune que ocurre en bovinos y ovinos sobre el metacestodo, se procesaron para análisis histológico 418 muestras de quistes hidatídicos, que generaron 674 bloques aptos para su análisis provenien-tes de 385 quistes hidatídicos (185 de bovinos y 200 de ovinos). En estas muestras se observó que existe un patrón diferencial de respuesta inmune en la capa adventi-cia; en bovinos, la capa adventicia, tanto en quistes hidatídicos fértiles como inférti-les, posee un infiltrado inflamatorio caracterizado por macrófagos en empalizada en contacto directo con la capa laminar del parásito, desorganización y necrosis de la capa laminar, centros germinales de linfocitos, calcificaciones, células gigantes multi-nucleadas y eosinófilos. Sorprendentemente, varias muestras de quistes hidatídicos infértiles en hígado y pulmón presentaron células del hospedero en contacto directo con la capa germinal, hecho sin precedentes en la literatura antes de la realización de esta investigación. Por otra parte, en ovinos, los quistes hidatídicos fértiles rara vez presentaron los componentes inflamatorios mencionados, y en quistes hidatídi-cos infértiles, si bien existe un componente inflamatorio en la capa adventicia, se en-cuentra generalmente bajo una capa de fibrosis que protege la capa laminar del pa-rásito. Respecto a la variabilidad intraespecífica de Echinococcus granulosus en bovinos y ovinos, se reporta la existencia de hasta 5 haplotipos diferentes dentro de un mismo hospedero. El hallazgo de que tanto bovinos como ovinos poseen múltiples haploti-pos del parásito en su interior tiene implicancias tanto en la epidemiología molecular del parásito así como en la posible detección de focos hiperendémicos de infección. Por otra parte, no existe una asociación del haplotipo con la fertilidad de los quistes hidatídicos o el patrón de capa adventicia; lo que confirma que la fertilidad de quistes hidatídicos está determinada individualmente por el hospedero. Finalmente, en bovi-nos, la co-infección con Fasciola hepatica posee un efecto paradojal, ya que altera la localización de los quistes hidatídico, además de disminuir el tamaño y cantidad de quistes hidatídicos que se pueden encontrar por hospedero. Estos efectos se pueden interpretar como una relación antagónica. Sin embargo, la presencia de Fasciola hepatica se asocia con una ausencia de segmentos de capa laminar dentro de la capa adventicia, células del hospedero dentro de la capa germinal y de centros germinales de linfocitos en la capa adventicia de quistes hepáticos y a ausencia de calcificaciones, necrosis bajo la capa laminar y macrófagos en empalizada bajo la capa laminar de quistes pulmonares, indicadores de una respuesta inmune menos intensa y por lo tanto sugerente de un efecto sinérgico. La comparación entre las capas adventicias de bovinos y ovinos, permite concluir finalmente que la diferencia de fertilidad de quistes hidatídicos entre ambas especies está dada por factores intrínsecos y no por la co-infección con Fasciola hepatica o factores moleculares de Echinococcus granulosus. Sin embargo, la co-infección pro-mueve un desplazamiento de quistes hidatídicos hacia los pulmones junto con un menor diámetro de quistes hidatídicos, lo que se podría interpretar como un antago-nismo entre ambos parásitos. Por otra parte, hay evidencias de un efecto sinérgico en la infección parasitaria, al haber menor inflamación en la capa adventicia de los quistes hidatídicos en animales co-infectados. Estos resultados demuestran lo complejo que resulta el análisis de enfermedades parasitarias en animales, ya que el po-liparasitismo ocurre de manera frecuente en los hospederos y rara vez es tomada en cuenta. Dado que dicho fenómeno puede alterar las características biológicas de los parásitos y en consecuencia, la forma en que la enfermedad se manifiesta en el hospedero, es que es un factor fundamental a tener en cuenta en infecciones naturales.

Polyparasitism, i.e. the occurrence of more than one parasite inside a host, is a well-documented fact in the medical, veterinary and zoological literature. Most of the ani-mals that live in natural environments as well as humans in rural areas, are hosts of different parasite species. Parasite helminths are a heterogenous group of organisms with different morphological and molecular features, which also adopt many different stages during their life cycles. To survive inside their host, these parasites use differ-ent strategies, such as migrating different viscera or establishing in one place. These different strategies are associated with the immune response triggered by the host. When there are different parasites modulating simultaneously the immune response, the interaction can be classified as synergic or antagonic, depending on the kind of immune response that is triggered. Generally, helminths elicit a Th2-like immune re-sponse, characterized by a Th2 cytokine profile, with regulatory T cells, alternative activated macrophages with secretion of IL-10 and TGF-β. Even though this response is very efficient in containing the parasite, rarely is able to eliminate it. In Chile, there are two zoonotic helminths that frequently co-habit the same rumiant host: Echinococcus granulosus and Fasciola hepatica. Both of them use the liver as their primary target, however, Echinococcus granulosus is able to disseminate to dif-ferent viscera, with lungs being its second preferred site. Both parasites are responsi-ble for causing diseases in human beings as well as economic losses in productive animals. The immune response triggered against both parasites is very similar. In fact, sera from animals immunized with Fasciola antigens recognize in immunoassays proteins from Echinococcus granulosus protoscoleces. Likewise, sera from animals immunized with Echinococcus granulosus antigens identify Fasciola antigens; this means that probably, the interaction between them should be synergic. However, in cattle, the presence of Fasciola hepatica is associated with changes in both the local-ization of Echinococcus granulosus hydatid cysts and their presentation rate in co-infected animals: the amount of hepatic hydatid cysts is lower and the amount of small hydatid cysts in lungs is higher. The interaction between parasites is also modulated by the host species, because of this, in this research work there are three main aspects: the immune response in cat-tle and sheep against the hydatid cysts and the relation with its fertility; the intraspe-cific variability of Echinococcus granulosus in cattle and sheep and its relation with both biological features and immune response against the metacestode; and finally, if Fasciola hepatica co-infection affects the development of hydatid cysts in cattle and sheep. Routine visits to abattoirs located in different regions of Chile were carried out, and hydatid cysts were collected from both cattle and sheep. For each slaughtered animal with Echinococcus granulosus infection, every hydatid cyst present in the viscera were collected and the presence of Fasciola hepatica was recorded. Each hydatid cyst was measured, and both DNA and cyst wall samples were collected for molecu-lar biology and histologic analysis, respectively. A total of 418 hydatid cysts were col-lected from 82 cattle and 117 sheep. In sheep, there were no animals co-infected with Fasciola hepatica, while in cattle, 20% of the samples had co-infection. Polyparasit-ism was only evaluated in cattle, while in sheep both haplotype and host immune re-sponse was evaluated in fertile and infertile hydatid cysts. To evaluate the immune response in cattle and sheep, the 418 hydatid cyst samples were processed for histo- logical analysis. After quality control, 674 paraffin blocks from 385 hydatid cysts (185 from cattle and 200 from sheep) were analyzed. In these samples, a differential im-mune response pattern was observed; in cattle, the adventitial layer, in both fertile and infertile hydatid cysts, has an inflammatory infiltrate characterized by palisading macrophages in direct contact with the parasite laminated layer, which is disor-ganized and has necrotic areas, lymphocyte germinal centers, calcifications, giant multinucleated cells and eosinophils. Surprisingly, infertile cysts in both liver and lungs had host immune cells in contact with the germinal layer, an unprecedented finding before this research work. In sheep, fertile hydatid cysts rarely feature inflam-matory infiltration, and while infertile hydatid cysts have an inflammatory component, usually is not in contact with the parasite laminated layer. Regarding Echinocccus granulosus intraspecific variability in cattle and sheep hydatid cysts, the presence of up to 5 different haplotypes within the same host is reported. This finding, reported in both cattle and sheep, in relevant for the molecular epidemi-ology of Echinococcus granulosus as well in the identification of hyperendemic areas. There was no association between Echinococcus granulosus haplotype and hydatid cyst fertility nor the immune response against the metacestode, which confirms that hydatid cyst fertility is dependent of the host. In cattle, polyparasitism of Echinococcus granulosus and Fasciola hepatica is para-doxical: co-infection was associated with antagonic interaction features, such as smaller and fewer hydatid cysts per animal and a lack of fertile hepatic hydatid cysts. However, it was also associated with synergic interaction features, with both fewer hepatic hydatid cysts with laminated layer disorganization, host cells within the germi-nal layer and lymphocyte germinal centers in the adventitial layer and fewer lung hy- datid cysts with calcifications, laminated layer necrosis and palisading macrophages under the laminated layer. The difference of hydatid cyst fertility between cattle and sheep is not determined nei-ther by Fasciola hepatica co-infection nor Echinococcus granulosus intraspecific vari-ability, as evidenced by the analysis of the adventitial layer. However, polyparasitism was associated with both synergic and antagonic interactions. These results highlight the complexity of the study of parasite natural infection in animals, because polypara-sitism in a common occurrence and rarely is given any consideration. Because poly-parasitism can affect biological features of the parasite, and in consequence, how the disease manifests in the host, is a factor that always has to be considered in natural infections.